副鸡禽杆菌摇瓶培养方法的研究

周欣怡，兰茜，王丽辉

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.西南大学，重庆 400715）

鸡传染性鼻炎（IC）是由副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum，A.paragallinarum，又称副鸡嗜血杆菌）引起的一种上呼吸道传染病，此病可以造成蛋鸡产蛋率下降（10%～40%）以及育成鸡和肉鸡生长迟缓，给养鸡业造成较大的经济损失，所以引起了养禽业的高度重视[1]。按照学者Page等的分型方法，可将副鸡禽杆菌分为A、B和C三个血清型，各型之间几乎不产生交叉保护[2-4]。我国于1986年首次在北京分离到副鸡禽杆菌，而后陆续在不同省、市、区分离到副鸡禽杆菌，经鉴定均为Page A型[5-8]。但副鸡禽杆菌的生物学特性较复杂，在培养过程中需加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和鸡血清，本研究利用摇瓶培养的方法可对其培养特性进行研究，便于后续适宜疫苗的生产研发。

1 材料

1.1 菌种

副鸡禽杆菌A型菌株C-Hpg-8株，由中国兽医药品监察室保管和供应。

1.2 培养基和试剂

多聚蛋白胨、酪蛋白氨基酸、胰蛋白胨大豆琼脂、胰蛋白大豆肉汤培养基，均购自美国BD公司；氯化钠等常规生化试剂，购自北京益利精细化学品有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），购自Roche公司；鸡血清，购自天津康源生物技术有限公司。

2 方 法

2.1 培养基的配制

2.1.1 鸡肉汤琼脂培养基

称取多聚蛋白胨3 g、酪蛋白胨3 g和氯化钠3 g，溶于1 000 mL鸡肉汤中，调pH至7.2，加入15 g琼脂，并经121℃高压灭菌15 min。

2.1.2 鸡肉汤液体培养基

称取多聚蛋白胨3 g、酪蛋白胨3 g、氯化钠3 g和鸡肉汤100 mL，加入纯化水至1 000 mL，调pH至7.2，并经121℃高压灭菌15 min。

2.1.3 半合成培养基

称取多聚蛋白胨1 g、酪蛋白胨3 g、谷氨酸钠2 g、酵母浸粉1 g、葡萄糖0.6 g和氯化钠3 g，溶于600 mL水中，115℃灭菌40 min，降至室温后加入10%无菌鸡血清和0.5%辅酶即成。

2.2 副鸡禽杆菌固体培养基的选择

将副鸡禽杆菌A型菌株接种于含1%鸡血清的鸡肉汤琼脂培养基上复苏后传代1次复壮，再同步接种于半合成培养基和鸡肉汤琼脂培养基上37℃、5%CO2培养箱中培养24～72 h，通过对固体培养基上菌落形态的观察并从中筛选出适合该菌株生长的固体培养基。

2.3 副鸡禽杆菌液体培养基的选择

将副鸡禽杆菌A型菌株接种于含1%鸡血清的鸡肉汤琼脂培养基上复苏后传代1次复壮，用接种环刮取1满环菌苔至5 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01 mol·mL-1）溶液中，吹打使菌体充分混匀。分别向100 mL的半合成培养基、胰蛋白大豆肉汤培养基和鸡肉汤液培养基中同步接种100 μL菌稀释液，置37℃摇床中培养24 h，分别于培养6、12、18 h和24 h时测定培养菌液中的活菌数，并从中筛选出适合该菌株生长的培养基。取副鸡禽杆菌A型菌在不同培养基中培养至菌数高峰时的培养物涂片并革兰氏染色，观察细菌的生长形态。

2.4 副鸡禽杆菌在液体培养基中生长曲线的研究

将副鸡禽杆菌A型菌株接种于鸡肉汤琼脂培养基上复苏后传代1次复壮，用接种环刮取1满环菌苔至5 mL PBS溶液中，吹打使菌体充分混匀。取100 μL加入100 mL鸡肉汤液体培养基中，置摇床中37℃振荡培养24 h。期间每2 h取样1次，分别进行活菌计数、OD600值和pH测定，绘制生长曲线。

2.5 摇瓶培养条件的优化

2.5.1 不同浓度NAD含量培养基的比较试验

将菌种复苏后传代1次复壮，用接种环刮取1满环菌苔至5 mL PBS溶液中，吹打使菌体充分混匀。在鸡血清浓度为5%的鸡肉汤液体培养基中分别添加1、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的NAD，置37℃摇床中振荡培养。根据细菌生长曲线，在培养18 h时取副鸡禽杆菌A培养物测定OD600值和活菌数，从而确定菌种最佳NAD浓度。

2.5.2 不同血清浓度对活菌数影响的比较试验

鸡肉汤液体培养基121℃灭菌15 min后向其中添加前面确定的最佳浓度NAD（10 μg·mL-1），并分别加入1%、2%和4%的已灭活的鸡血清。取复苏好的副鸡禽杆菌进行1次传代复壮后，用接种环刮取1满环菌苔至5 mL PBS溶液中，吹打使菌体充分混匀。分别取该悬液100 μL加入到100 mL添加了不同浓度血清的鸡肉汤液体培养基中，放入摇床中37℃振荡培养。根据细菌生长曲线，在培养18 h时取副鸡禽杆菌A型培养物测定OD600值和活菌数，从而确定菌种最佳血清浓度。

2.5.3 培养基灭菌条件对活菌数影响的比较试验

分别按照121℃15 min、121℃30 min、121℃60 min、116℃40 min对鸡肉汤液体培养基进行灭菌。待培养基恢复至室温后，向其中添加前面确定的最佳浓度的鸡血清（2%）和NAD（10 μg·mL-1）。取复苏好的副鸡禽杆菌A型菌进行1次传代复壮，然后用接种环刮取1满环菌苔至5 mL PBS溶液中，吹打使菌体充分混匀制得菌悬液。分别取该菌悬液100 μL加入到经不同条件灭菌的100 mL鸡肉汤液体养基中，37℃摇床培养，在培养18 h时取培养物测定OD600值和活菌数，从而确定液体培养基的最佳灭菌条件。

3 结果与分析

3.1 副鸡禽杆菌固体培养基的选择结果

副鸡禽杆菌A型菌在几种固体培养基上培养不同时间后的菌落大小见表1。

由表1可知，副鸡禽杆菌A型菌适合在鸡肉汤琼脂培养基中生长。

表1 培养不同时间后固体培养基上的菌落大小

3.2 副鸡禽杆菌液体培养基的选择结果

副鸡禽杆菌A型菌在不同的液体培养基中活菌数见表2。

由表2可知，副鸡禽杆菌A型菌在鸡肉汤液体培养基中的生长状况优于其他培养基。在鸡肉汤培养基中培养18 h后的活菌数达到最高为3.2×109cfu·mL-1。

表2 不同液体培养基中的细菌菌数

取副鸡禽杆菌A型菌在不同培养基中培养至菌数高峰时的培养物涂片后，进行革兰氏染色，观察细菌的生长形态。镜下可见鸡肉汤液体培养基中的菌体饱满、大小均一，而在其他培养基上其菌落形态有一定变化。通过对菌落形态、液体培养时的活菌数确定鸡肉汤液体培养基为最佳液体培养基。

3.3 副鸡禽杆菌在液体培养基中生长曲线的研究

液体培养时副鸡禽杆菌生长曲线见图1，培养物OD600值与pH随时间变化的规律见表3。

图1 副鸡禽杆菌A型菌生长曲线

表3 液体培养时副鸡禽杆菌A型培养物中OD600值与pH随时间变化的规律

由图1和表3可知，副鸡禽杆菌液体培养时可在16～18 h达到高峰，其pH下降也较快，至20 h左右时达到最低。

3.4 摇瓶培养条件的优化

3.4.1 不同浓度NAD含量培养基的比较试验结果

培养18 h测定不同NAD添加量对培养物中活菌数的影响，结果见表4。

由表4可知，增加NAD的添加量可显著提高培养物中的活菌数，其中添加量为10 μg·mL-1时，细菌培养物中的活菌数均高于低浓度组。但是对于副鸡禽杆菌A型菌，当添加量为20 μg·mL-1时，菌数的增加有限。考虑到成本因素，将液体培养时的NAD添加量定为10 μg·mL-1。

表4 不同NAD添加量对培养物中活菌数的影响 cfu·mL-1

3.4.2 不同血清浓度对活菌数影响的比较试验

培养18 h测定不同鸡血清添加量对培养物中活菌数的影响，结果见表5。

由表5可知，液体培养基中鸡血清的含量可影响培养物中的活菌数，当鸡血清的添加量为2%时，比添加1%时提高，继续提高添加量至4%对液体培养时副鸡禽杆菌菌数的影响不大。考虑到生产成本因素，将液体培养基中鸡血清的添加量定为2%。

表5 不同鸡血清添加量对培养物中活菌计数的影响 cfu·mL-1

3.4.3 培养基灭菌条件对菌数影响的比较试验

培养基灭菌条件对活菌数的影响见表6。

由表6可知，液体培养基的灭菌条件会显著影响细菌培养物中的活菌数，灭菌时间越长，培养物中的活菌数越少。可能是由于培养基中的有效成分在长时间的灭菌过程中被破坏，细菌无法利用所致，因此确定最佳灭菌条件为121℃15 min。

表6 培养基灭菌条件对活菌数的影响

4 结 论

通过对培养基种类、血清的添加量、NAD添加量进行优化和筛选，结果表明鸡肉汤琼脂培养基和鸡肉汤液体培养基是作为疫苗鸡禽杆菌A型株生长的最适培养基；培养基中NAD的最适浓度为10 μg·mL-1；血清最适添加量为2%，培养基最佳灭菌条件为121℃15 min，摇瓶培养的最佳培养时间为18 h。