脑胶质瘤超极化13C-MRI 研究进展

谯金果 吴昊 张伟国*

超极化13C-MRI 是一种通过注射13C 标记的外源性生物探针，在分子层面无创性地探测正常组织和肿瘤组织中13C 的代谢途径的方法，有别于1HMRS 和FDG-PET 等代谢成像。超极化13C-MRI 能够对以往无法显示的代谢途径和生理过程进行快速、非电离、实时分析。近年对超极化13C-MRI 在胶质瘤代谢成像方面的应用，包括WHO Ⅳ级肿瘤(胶质母细胞瘤及其变体)和Ⅲ级肿瘤(星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和少突星形细胞瘤的间变性变体)的研究日益增多。目前，超极化13C-MRI 在胶质瘤细胞内反应、药物效力、支链氨基酸代谢、氧化还原水平等方面的实验研究取得了进展，部分常用探针（如[1-13C]-丙酮酸）的超极化13C 成像也进入临床实验阶段。本文将以胶质瘤代谢成像为重点，介绍超极化13C-MRI 最新的实验和临床研究进展。

1 超极化13C-MRI 的成像原理

在室温和临床MRI 磁场下，体内的13C 原子核由于受天然丰度（1.15%）和旋磁比（1H 的1/4）的限制，其MRI 信号强度仅为1H 信号强度的1.6%。欲解决13C 原子信号弱的问题，则需提高原子的丰度和自旋极化能级。Overhauser[1]在1953 年首次提出动态核极化（dynamic nuclear polarization，DNP）的概念，即在低温（1~2 K）和中等强度磁场（3.35～6.7 T）环境下，将高度极化的自由电子自旋转移到原子核自旋，从而短暂提高室温下原子核的信号强度；2003 年Ardenkjaer-Larsen 等[2]发明了溶解性动态核极化（dissolution-DNP，d-DNP），令富集后的固态超极化13C 探针（13C 丰度＞95%）溶解并转移至生物体内，使得MRI 信号增强10 000~100 000 倍，进而获取探针相关的代谢反应、代谢产物运输、生物灌注等信息。这种成像方法被称作超极化13C-MRI。

超极化13C 成像的优势在于其探针的多样性。由于C 原子参与构成所有生物分子的基本骨架，因此任何生物分子都具备成为超极化13C 生物探针的潜力。但超极化13C 探针应满足以下3 个条件：①具有较长的自旋-晶格弛豫时间（T1），便于探针及其代谢产物的观察和量化；②探针与其代谢产物的化学位移差较大，便于在波谱上区分；③探针在生理酸碱度下可溶且能够快速参与代谢，提供足够的观测窗口。现已有多种超极化13C 探针用于胶质瘤的能量代谢、药物效力、氧化还原状态等方面的研究，包括[1-13C]-丙酮酸、[2-13C]-丙酮酸、[1-13C]-谷氨酰胺和[1-13C]-抗坏血酸等。

2 血脑屏障对超极化13C-MRI 的影响

超极化13C-MRI 用于胶质瘤研究时，血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）可能会限制部分探针的通过，进而降低MR 影像和波谱的质量。[1-13C]-丙酮酸、[2-13C]-丙酮酸的浓度以及转化为乳酸（lactic acid，Lac）的表观速率常数（kPL）在大脑（0.012 s-1）明显低于肝脏和肾脏（分别为0.02 s-1、0.028 s-1）[3-4]。不同的麻醉药物也会导致代谢速率的明显差异，Marjańska 等[5]研究表明，使用异氟醚或类似的麻醉剂有利于Lac 的检测，而吗啡可以最大化增加超极化13C探针的下游产物，可能与BBB 的通透性增加相关。Miller 等[6]对模型猪大脑进行麻醉发现，麻醉的深度同样会影响探针的代谢速率，麻醉剂对探针具有抑制作用，而探针对其具有剂量依赖性；此外，实验还发现通过注射甘露醇能够开放BBB，解除麻醉药物的抑制作用后，脑内的[1-13C]-丙酮酸浓度和kPL得到显著提升。由于动物实验常常行浅麻醉，而临床实验未采取麻醉措施，这可能是导致动物实验和临床实验结果出现明显差异的原因。

尽管BBB 是胶质瘤超极化13C-MRI 的限制因素，但对临床实验的影响并不严重。临床实验中，探针的注射剂量远大于动物实验，且无麻醉潜在的增益或抑制作用，探针在脑内的浓度足以完成超极化13C-MRI 在胶质瘤方面的研究。

3 胶质瘤超极化13C-MRI 实验研究

3.1 有氧糖酵解和氧化磷酸化超极化13C-MRI肿瘤细胞倾向于将葡萄糖直接“发酵”成Lac，这种现象被称为有氧糖酵解[7]。丙酮酸位于糖酵解途径和三羧酸循环的交汇点，既可经乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）催化转化为Lac，也可经丙酮酸脱氢酶（pyruvic dehydrogenase，PDH）催化最终转变为碳酸氢盐（HCO3-），这2 种产物可以反映肿瘤细胞有氧糖酵解和氧化磷酸化的水平，所以[1-13C]-丙酮酸是研究肿瘤细胞能量代谢的理想探针，也是目前应用最为广泛的超极化13C 探针。

[1-13C]-丙酮酸探针的主要代谢产物[1-13C]-Lac，在肿瘤有氧糖酵解方面的研究有广泛应用。在Lac 增高的小鼠胶质瘤模型中，经过糖酵解抑制剂治疗的小鼠可观察到[1-13C]-Lac 减少和kPL降低；在放、化疗及联合治疗、抗血管内皮生长因子抗体治疗等研究中也可观察到类似结果[8-11]。这些研究中的[1-13C]-Lac 减少和kPL降低都先于常规MRI 检查中所见到的肿瘤体积变化。由此可见，[1-13C]-丙酮酸探针的使用有利于评估肿瘤的早期治疗效果。同时，[1-13C]-丙酮酸探针也可用于分析[1-13C]-Lac 的调控因素。组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗后的胶质瘤细胞，单羧酸转运蛋白1/4 的活性增加可导致[1-13C]-Lac 减少[12]；替莫唑胺治疗后的胶质瘤细胞，由丙酮酸激酶2 活性降低能够介导[1-13C]-Lac 减少[13]；IDH1 突变型胶质瘤的低水平[1-13C]-Lac 则归因于LDH-A 的缺失[14]。因此，[1-13C]-丙酮酸探针可用于探究药物作用机制和寻找新的治疗靶点。

[1-13C]-丙酮酸探针的另一个代谢产物为[13C]-HCO3-，主要用于研究肿瘤的氧化磷酸化水平。虽然丙酮酸的中间产物乙酰辅酶A 可能进入脂质途径，导致[13C]-HCO3-减少而使结果存在偏差，但大脑很少进行脂质合成，所以[1-13C]-丙酮酸转化为[13C]-HCO3-的表观速率常数（kPB）也足以评估细胞的氧化磷酸化水平，这在胶质瘤相关的动物实验和临床实验中得到佐证[14-15]。有研究[16-17]认为，[2-13C]-丙酮酸的代谢产物[5-13C]-谷氨酸（glutamic acid，Glu）可能比[13C]-HCO3-盐能够更直接、准确地反映细胞氧化磷酸化水平；因为[1-13C]-Lac/[5-13C]-Glu 反映了丙酮酸在三羧酸循环的代谢结果，而[1-13C]-Lac/[13C]-HCO3-更注重反映PDH 和LDH 活性。Salzillo 等[18]使用[1-13C]-丙酮酸观察胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）在进展期、治疗前后、复发等关键时期的动态代谢变化，结果发现有氧糖酵解和氧化磷酸化的显著异常，证明[1-13C]-丙酮酸探针在区分脑内良恶性肿瘤、区分GBM 的假性和真性进展以及预测复发等方面具有指导意义。

3.2 氨基酸及其代谢产物的超极化13C-MRI 研究 氨基酸及其代谢产物包括还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、还原型辅酶Ⅱ、脱氢抗坏血酸和维生素C 等，与肿瘤调控氧化还原水平有关，部分代谢产物很难通过传统影像学检查直接观察或量化，但超极化13C-MRI 提供了可能。Batsios 等[19]将γ-谷氨酰-[1-13C]-甘氨酸注射于大鼠胶质瘤模型中，荷瘤大鼠的代谢产物[1-13C]-甘氨酸含量明显高于健康大鼠对照组，该反应由γ-谷氨酰转移酶（γglutamyl transferase，GGT）介导，活性升高的GGT 与GSH 水平直接相关，而GSH 可以反映肿瘤细胞的氧化还原水平。因此，γ-谷氨酰-[1-13C]-甘氨酸探针有助于评估胶质瘤的氧化还原水平。

支链氨基酸（BCAA）对肿瘤增殖至关重要，过表达的支链氨基酸氨基转移酶1（branched chain amino acid transferase 1，BCAT1）往往意味着恶性肿瘤预后不良[20]。Suh 等[21]在小鼠胶质瘤模型中注射[1-13C]-α-酮异己酸（α-ketoisocaproic acid，α-KIC）后发现，由BCAT1 介导生成的[1-13C]-亮氨酸减少，而由α-酮酸脱氢酶复合物（branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex，BCKDC）介导生成的[13C]-HCO3-增加，这说明胶质瘤中的α-KIC 倾向于氧化供能而不是通过转氨基生成亮氨酸。在继续注射[U-13C]-亮氨酸后，观察到亮氨酸净转化为α-KIC，提示胶质瘤中BCAA 可能通过BCAT1/BCKDC的上调以增强氧化代谢。因此，[1-13C]-α-KIC 探针在氨基酸代谢失调的领域中具备应用潜力。

3.3 IDH 突变胶质瘤的超极化13C-MRI 研究 研究[22]表明，70%~90%的Ⅱ/Ⅲ级胶质瘤和继发性GBM存在IDH 突变，这种突变导致肿瘤细胞内的α-酮戊二酸（α-KG）没有转化为常规代谢产物琥珀酰辅酶A，而是转化为一种新的代谢产物2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutaric acid，2-HG），2-HG 被认为是IDH突变型胶质瘤的驱动因素[23]。Salamanca-Cardona 等[24]在体外模型直接观察到[1-13C]-谷氨酰胺向[1-13C]2-HG 的快速转化，而注射[U-13C]-葡萄糖后，监测到体外模型80%以上的[1-13C]2-HG 来自于[1-13C]-谷氨酰胺，证明谷氨酰胺是2-HG 的特定来源。Ruiz-Rodado 等[25]进一步采用[1-13C]-丙酮酸追踪IDH 胶质瘤模型中13C 的代谢，再利用[U-13C]-葡萄糖和[U-13C]-谷氨酰胺验证，也得到上述结论。该研究还发现在肿瘤区域存在多种氨基酸失调，且IDH突变胶质瘤升高的[1-13C]-Lac 并非来自于[U-13C]-葡萄糖的直接代谢，而是源于[U-13C]-谷氨酰胺的糖异生，揭示了IDH 突变胶质瘤主要的代谢改变。

3.4 胶质瘤超极化13C-MRI 在其他领域的研究 胶质瘤超极化13C-MRI 在胶质瘤细胞内外pH 的实时监测、胶质瘤的灌注显像等方面也取得了一定的进展。细胞内外pH 可以影响HCO3-和CO2之间的快速交换，与正常细胞相反，胶质瘤细胞内的pH 值往往大于细胞外。Lim 等[26]使用[13C]-碳酸铯对肿瘤细胞内外pH 行超极化13C-MRI 研究，记录肿瘤进展过程中多个时间点的细胞内/外pH 值，发现细胞内外pH 差值随着肿瘤的体积增大而升高。这是对胶质瘤细胞内外酸碱度的首次超极化13C-MRI，将来可能有助于指导胶质瘤的治疗决策和评估治疗效果。

目前，[13C]-尿素在心血管疾病、肾脏疾病和部分肿瘤（如前列腺癌）的超极化13C-MRI 灌注研究领域应用广泛[27]，但由于BBB 会限制尿素的通过，脑内[13C]-尿素浓度过低，使得胶质瘤领域的超极化13C-MRI 灌注研究较难开展。Park 等[28]开发了一种新的灌注探针[13C]-羟甲基环丙烷，比[13C]-尿素的T1时间更长且更容易穿过BBB，研究成功观察到胶质瘤模型的血流灌注增加。随后，Park 等[29]研究发现[1-13C]-丙酮酸成像的标准化Lac 盐、含13C 标志物的信号总和与动态磁敏感增强MRI 灌注参数呈强相关，提示[1-13C]-丙酮酸的成像参数也可以推断胶质瘤灌注情况，这为胶质瘤的超极化13C-MRI 灌注显像提供了新的研究方向。

4 胶质瘤超极化13C-MRI 临床研究

4.1 首次用于胶质瘤病人 2018 年Miloushev 等[30]首次将超极化13C-MRI 应用于胶质瘤病人，经静脉注射[1-13C]-丙酮酸，11.7 s 后可通过MRS 监测到脑内相应的[1-13C]-丙酮酸信号、下游产物[1-13C]-Lac和[13C]-HCO3-信号。目前，[13C]-HCO3-的信号强度较弱而无法量化，但[1-13C]-Lac 信号强度足够，可观测到显著的[1-13C]-Lac 峰和kPL升高，且在注射后23 s 可以被量化。与常规MRI、增强MRI 以及FDGPET/CT 相比，超极化13C-MRI 在胶质瘤领域同样可以快速评估肿瘤代谢，为后续的临床研究奠定了基础。

4.2 临床研究进展 Autry 等[31]对3 名健康志愿者和5 例胶质瘤病人行[1-13C]-丙酮酸成像，参照首次临床实验，[1-13C]-丙酮酸注射剂量为0.43 mL/kg、注射流率5 mL/s，最后注射20 mL 生理盐水，以kPL和kPB作为对比指标。结果显示胶质瘤病人的正常脑白质区域与健康志愿者的脑白质区域的kPL和kPB相仿，这表明胶质瘤病人的正常脑白质区域可能是一个合适的对照区域，无需设置额外的健康对照组。病人经过贝伐单抗治疗后，kPL和kPB整体升高，这可能和BBB 的渗透性改变有关。在复发进展的胶质瘤中，无论增强MRI 上是否能观察到异常强化灶，超极化13C-MRI 都能观察到kPL升高，可见[1-13C]-丙酮酸成像对胶质瘤代谢的细微变化更加敏感，对于胶质瘤的早期诊断和治疗评估具有重要价值。

Grist 等[32]对4 名健康志愿者进行超极化13C-MRI检查，尝试对正常大脑中的丙酮酸代谢进行观察量化，结果显示在BBB 完整的情况下，[1-13C]-丙酮酸成像可以采集到kPL和kPB信息，且与其他临床研究[29-30]的结果一致；同时这些研究发现，在大脑的灰质和白质之间，丙酮酸代谢存在显著差异，在灰质中更加活跃。正常大脑的超极化13C-MRI 对后续病理大脑的代谢研究有重要意义，需要更多受试者的参与和数据采集的标准化，这意味着更大规模的临床实验和多机构合作，也是超极化13C-MRI 发展中面临的挑战。

此外，Autry 等[15]首次将超极化13C-MRI 应用于6 例儿童病人，评估了[1-13C]-丙酮酸的2 种注射剂量，即成人耐受剂量（0.43 mL/kg）和较低剂量（0.34 mL/kg），注射流率1~3 mL/s，均未观察到剂量限制性毒性或不良事件，证明了超极化13C-MRI 的安全性和耐受性。相比于成人，儿童在注射[1-13C]-丙酮酸后能够更快地将其输送到大脑，这可能与儿童的单羧酸转运蛋白活性更高有关，但这并不意味着儿童大脑的成像效果比成人的更好。相反，儿童的超极化13C-MRI 往往受到更多其他条件影响。此外，对于儿童成像时是否应该麻醉目前尚存争议。首先，麻醉可能会降低BBB 通透性，进而降低大脑的探针浓度；其次，较低的注射剂量会进一步降低探针浓度，最终导致超极化13C-MRI 成像失败；但不麻醉的儿童病人，在检查期间依从性较差。值得说明的是，此次试验实际纳入的10 名儿童均未麻醉，其中4 名因注射[1-13C]-丙酮酸失败退出，余6名儿童中有3 名未能接受最大剂量，仅3 名儿童注射了成人耐受剂量。这是未来在儿童群体中应用超极化13C-MRI 必须讨论的问题。

[2-13C]-丙酮酸的超极化13C-MRI 同样具备相当的安全性和耐受性，Chung 等[33]采用与[1-13C]-丙酮酸相同的注射剂量和速度，成功观察并测定了[2-13C]-丙酮酸、[2-13C]-Lac、[5-13C]-Glu 及代谢产物的浓度，且[2-13C]-丙酮酸的kPL和[1-13C]-丙酮酸的kPL一致。由于[2-13C]-丙酮酸的代谢产物[5-13C]-Glu 对细胞氧化磷酸化水平的评估更加直接、准确，所以其较[1-13C]-丙酮酸成像在相关疾病（如神经退行性病变）中应用更具潜力。

5 小结

在过去10 年中，超极化13C-MRI 的相关研究已经证明该技术可以作为一项新的脑肿瘤成像方法。超极化13C-MRI 敏感度高，可以实时、快速和无创探测活体组织代谢，能够对不同肿瘤的不同代谢产物进行检测，为神经系统疾病的生物学研究提供了新的视野。目前，实验和临床研究领域针对不同的代谢途径已开发多种超极化13C 探针，将进一步推动超极化13C-MRI 的临床应用。