乳酸菌细菌素抑菌特性及在食品中的应用研究进展

杜 琨

（武警工程大学 装备管理与保障学院，陕西 西安 710086）

乳酸菌细菌素是乳酸菌代谢过程中产生的一类具有抗菌活性的小分子肽类物质，大多是以30～60个氨基酸组成的小分子形式存在。多数产细菌素的乳酸菌是从酸奶、泡菜、酸菜等中分离得到，可被人体内蛋白酶降解，对肠道微生物群不会产生太大影响，被公认为安全级（generally recognized as safe，GRAS），因而常被用作食品防腐剂[1-4]。

乳酸菌素可以抑制或杀灭许多致病菌和腐败菌[5-7]，包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单核细胞增生利斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）等[8]。但其抑制或杀灭的菌大多数为革兰氏阳性菌，少数乳酸菌产生的乳酸菌素能抑制革兰氏阴性菌的生长[9]。到目前为止已发现7种不同属的乳酸菌可产生抑菌活性物质[10-11]。近年来，人们对乳酸菌素进行了深入研究，有大量关于天然乳酸菌细菌素特征的详细报道，但只有少数被证明在生物医学和食品领域有用，如乳链球菌素（Lacticin）和乳酸链球菌素（Nisin）[12-13]。

研究表明，乳酸菌细菌素具有以下特点[14]：①乳酸菌细菌素是蛋白类或肽类物质，由核糖体合成，进入人体后被迅速分解，不影响肠道菌群；②大部分乳酸菌细菌素对热稳定，溶于水，不受紫外线等的影响；③乳酸菌细菌素对亲缘较近的种属有抑制作用，杀菌方式呈现不可逆，对人体无害；④产细菌素的菌株自身具有免疫力。

1 乳酸菌细菌素的分类

根据乳酸菌细菌素的化学结构、作用方式、相对分子质量、抗菌谱、热稳定性和输出机制等，将乳酸菌细菌素分为三类，I类羊毛硫细菌素、II类细菌素、Ⅲ类细菌素及Ⅳ类细菌素，II类细菌素进一步可分为IIa、IIb、IIc和IId 4个亚类[15]。

第I类乳酸菌细菌素为羊毛硫细菌素（Lantibiotics），分子质量＜5 kDa，由19～50个氨基酸分子组成[16]，分子内含有羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、赖氨酸丙氨酸、2,3-双脱氢丙氨酸、（Z）-2,3-双脱氢丁氨酸、β-羟基天冬氨酸、S-（2-氨基乙烯基）-D-半胱氨酸等非编码氨基酸，对热稳定、对革兰氏阳性菌有较宽抗菌谱（葡萄球菌、链球菌、李斯特菌属、杆菌和肠球菌）。

第II类乳酸菌细菌素不含羊毛硫氨酸、对热稳定[17]，分子质量＜10 kDa。包括IIa、IIb、IIc和IId 4个亚类，其中IIa类细菌素是II类细菌素中主要的亚种，抗菌谱相比Ⅰ类细菌素较窄，其中植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）产生的乳酸片球菌素为主要代表；IIb类细菌素是由两种不同的肽分子组成的多肽，当每种肽的肽比率相等时才会发挥协同作用，产生最佳抗微生物活性；Ⅱc类细菌素的分子主链具有头－尾环化的结构特征；Ⅱd类细菌素包括非单线性肽，依赖于sec分泌途径的细菌素以及具有N-末端前导序列，并在翻译后立即有活性的无前导序列细菌素。

第Ⅲ类乳酸菌细菌素为热敏感大分子蛋白，分子质量＞30 kDa，以维生素J为主要代表，此外还包括lysostaphin，enterolysin A，helveticin J等细菌素。

第Ⅳ类乳酸菌细菌素为大分子复合细菌素，其活性成分含有蛋白质、类脂、碳水化合物等，包括Lactocin 27，Plantaricin S等细菌素。

根据乳酸菌细菌素产生菌的种属不同，将细菌素分为六类[18-19]：①乳球菌属细菌素，有乳酸链球菌素（Nisin）、双球菌素（Diplococcin）、乳链菌素（Lacticin）、乳球菌素（Lactococcin）。②片球菌属细菌素，有PA-1、AcH以及啤酒片球菌（P.cerevesiae）FBB63和乳酸片球菌（P.acidilactici）PC产生的未命名的细菌素。③明串珠菌属（Leuconostoc）细菌素，有Leucocin A、Carnocin、Mesenterocin。④肉食杆菌属（Carnobacteriocin）细菌素，有Carnocin U149、Carnobacteriocin A1、Carnobacteriocin A2、Carnobacteriocin A3、Carnobacteriocin B1、Carnobacteriocin B2。⑤乳杆菌属（Lactobacillus）细菌素，有Sakaein A、Sakaein M、Sakacin P、Plantaricin A、Plantaricin B、Plantaricin C、Plantariein ST、Plantariein BN、laCtocin S、Curvaein A、Breviein、Helveniiein J、Helventiein V-1829、Lactocin 27、Caseiein80、Bavaein MN、Fennenticin Lactocin F、Lactocin B等近20种。⑥肠球菌属产细菌素，有7C5、EnterocinA、Enterocin B等。

2 乳酸菌细菌素的研究现状

2.1 国外研究现状

在菌株筛选方面，TROPCHEVA R等[20]从保加利亚传统发酵乳中分离出具有抑菌功能的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）；MATEI A等[21]从腌菜中筛选出抑制黄曲霉和黑曲霉毒素的乳酸菌株。

在应用方面，LYNCH K M等[22]将淀粉乳杆菌用于切达干酪，可延长霉菌变质时间；AHLBERG S H等[23]将分离的乳酸菌应用于饲料中黄曲霉毒素的抑制，效果良好。

2.2 国内研究现状

我国于20世纪80年代开始对乳酸菌细菌素进行研究，1988年中科院微生物研究所开始对Nisin进行研究，并对产Nisin的菌株进行分离研究，1992年中试成功后，开始了对Nisin的商业化生产。目前，国内乳酸菌细菌素的研究主要包括Nisin的作用机制、影响Nisin活力的因素、遗传学、发酵条件优化、基因定位、结构基因扩增、构建克隆菌株等方面。

在菌株筛选方面，马国涵等[24]从大菱鲆肠道中，分离筛选出广谱拮抗活性乳酸菌；王海宽等[25]从传统发酵制品中筛选出的植物乳杆菌，对霉菌有明显的拮抗作用；张开屏等[26]从内蒙牧区风干牛肉制品中分离出肉源乳酸菌菌株，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果明显。

在应用方面，顾彬涛[27]从猪粪便分离乳酸菌，通过抑菌活性和耐受性试验筛选益生作用良好的乳酸菌菌株，体外实验应用抑菌效果良好。曹海鹏等[28]从黔北黑猪肠道黏膜分离出益生菌，添加入饲料中，抑菌效果明显。

3 乳酸菌细菌素的抑菌特性[29]

乳酸菌细菌素是乳酸菌代谢产生的具有抗菌活性的蛋白质、多肽类物质，乳酸菌对其产生的细菌素具有免疫性。普遍认为细菌素的抑菌分为两个步骤，先是细菌素专一的吸附到细胞表面的受体上，然后与细胞特异性或非特异性受体结合，最后杀菌。不同结构的乳酸菌细菌素，抑菌作用方式和活性也不同。

3.1 羊毛硫细菌素抑菌特性

Nisin是一个带正电荷的阳离子分子，在缺乏阴离子膜磷脂的情况下，Nisin起阴离子选择载体的作用；当存在阴离子膜磷脂时，Nisin吸附在膜上，利用离子间相互作用，及其分子的C末端和N末端对膜结构产生作用形成穿膜“孔道”，从而引起胞内物质泄漏，导致细胞解体死亡。Nisin对营养细胞的作用点是细胞质膜。它能抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，使细胞壁质膜和磷脂化合物合成受阻，引起细胞内含物和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）外泻，使细胞裂解。张玉鑫等[30-31]认为，Nisin具有潜在的跨膜序列及高的偶极矩能使膜产生孔道，同时使膜内外电位差和梯度丧失，破坏细胞通过电子传递链产生能量的能力。

3.2 小分子热稳定肽抑菌特性

Ⅱa类细菌素的抑菌机理与Nisin不同，其抑菌机理主要是由于细菌素吸附在细胞膜上并形成孔道，增加了细胞膜的通透性，引起细胞内各种离子的渗漏和能量物质的消耗，导致细胞解体死亡。Ⅱa类细菌素N端的发夹结构（Tyr-Gly-Asn-Gly-Val，YGNGV）可为细胞膜上的蛋白受体特异识别，使发夹结构带正电荷的β折叠与膜上带负电荷的磷脂以静电引力结合到靶细胞上。当Ⅱa类细菌素结合到敏感细胞膜上后，膜上的脂质酞基与疏水性的C端发生反应，并插入膜内聚集形成充水的膜孔道[32-35]。

Ⅱa类细菌素在细胞膜上形成孔道，导致膜内外离子失衡，磷酸盐的渗漏。膜内外离子的失衡使得质子驱动力（proton motive force，PMF）的耗散，而PMF可影响pH梯度（△pH）和跨膜电位（△Ψ）[36-39]。YAMAZAKI K等[40]报道，尽管在质膜上的成孔机理不同的细菌素不尽相同，但抗菌模式都是一样的。

3.3 热敏感大分子蛋白细菌素抑菌特性

热敏感大分子蛋白细菌素由乳杆菌属产生，有lacticin A、lacticin B、helveticin J和caseicin 80[41]等。目前对热敏感大分子蛋白细菌素的研究报道不多，EIJSINK V等[42]研究认为，热敏感大分子蛋白细菌素转运、修饰加工和免疫的基因应该与hly J基因紧密连锁。

3.4 大分子复合细菌素抑菌特性

许多学者在研究细菌素的过程中，先后发现了一些拮抗物质[43]，它们是某些细菌代谢产生的蛋白或多肽类物质，除了能抑制革兰氏阳性菌外，还能抑制革兰氏阴性菌和真菌，1958年，这类物质被国外的学者命名为类细菌素（bacteriocins-hkesubstance），并对其开始研究。在国外，类细菌素的研究与应用已日趋成熟；在我国，类细菌素的研究和生产尚处于初级阶段[43]。随着人们的不断深入研究，越来越多的类细菌素将被开发出来，以其抑菌谱宽、高效、安全的特点越来越受到食品工业的青睐。

4 乳酸菌细菌素的应用

4.1 在乳制品中的应用

乳制品营养丰富，是微生物良好的培养基，极易发生腐败变质。乳制品属于热敏性的物料，巴氏杀菌虽避免了高温杀菌对营养物质的损失和风味的改变，但乳制品中仍残留一部分细菌和耐热芽孢，并产生一定的毒素，缩短了乳制品的货架期，加入乳酸菌细菌素虽不能杀死芽孢杆菌，但可以抑制其生长，使其不产毒素，从而达到延长乳制品保质期的目的。

植物乳杆菌的代谢产物在乳制品中应用广泛，被归类于非发酵剂乳酸菌[44]，对保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的生长在某些条件下具有抑制作用[45]，常用于预防酸奶后酸化。李红娟等[46]从发酵乳制品中分离出具有抗青霉特性的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），并应用于乳品中，抗青霉效果良好。

4.2 在肉制品中的应用

在肉制品的保藏中，传统使用亚硝酸盐和硝酸盐等抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长，当人们食用肉制品时，一部分亚硝酸盐也进入人体，并与体内的胺类物质作用，生成一种强烈的致癌物质—亚硝胺化合物。Nisin能抑制肉制品中微生物的生长，尤其是抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长。Nisin本身在酸性活性最强，能降低肉制品的pH值，低pH值能降低残留亚硝酸盐的含量，避免对人体的危害，保证肉制品安全[47]。

PAIK H D等[48]研究添加Nisin在牛肉制品中保藏期间的质量变化情况。添加Nisin的处理组和对照组比较，添加Nisin的处理组与对照组相比嗜热微生物数量显著降低，在牛肉制品的颜色上，对照组与添加Nisin的处理组相比，对照组牛肉颜色变化明显。Nisin在肉制品中主要应用于香肠、冷却肉、真空包装的新鲜牛肉、咸猪肉、熏猪肉、火腿等的保藏中。吴学友等[49]采用对李斯特菌具有专一抑制作用的乳酸菌细菌素处理冷鲜鸡肉进行储藏试验，研究发现可有效延长冷鲜鸡肉储藏期。方士元等[50]研究发现，乳酸菌细菌素对海水鱼保鲜有延长货架期的效果。

4.3 在啤酒酿造中的应用

啤酒的营养丰富，是微生物良好的培养基，但啤酒生产中如消毒处理不善，极易受到啤酒片球菌（Pediococcus cerevisiae）和乳酸杆菌的的污染，造成啤酒浑浊、发黏、酸变等现象，引起风味发生改变。而加入乳酸菌肽可杀死杂菌，又不抑制酵母菌的生长，还可以延长啤酒的货架期。

将Nisin加入扩大培养啤酒酵母菌所用的冷麦汁中，可杀死酒母中的革兰氏阳性细菌，使酒母免受污染。在发酵醪中加入Nisin，可以抑制发酵过程中片球菌、乳杆菌等杂菌的生长；在啤酒酿造过程中，传统的酸洗法降低了酵母菌的发酵力、生命力和凝聚力，如果在酿造过程中添加Nisin，可杀死酵母菌中污染的乳酸菌，而酵母菌则不受影响；在生啤中添加Nisin，无需巴氏杀菌，就能将桶装或瓶装啤酒的货架期延长1～2倍；在熟啤酒添加Nisin，可以降低灭菌的强度，节省能源，改善啤酒口味，降低蒸汽消耗量。

4.4 在罐头食品中的应用

在酸性条件下，Nisin的溶解度、稳定性和活性都增强，因而高酸性食品的防腐可添加Nisin。在低酸和非酸性罐头食品中添加Nisin，可减轻杀菌强度，节约能耗。常规的罐头食品，在杀菌处理时很难将耐热细菌芽孢，如热解糖梭菌（Clostridium thermosaccharolyticum）的耐热芽孢和嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）彻底杀死，条件适宜时，它们就会生长繁殖，导致罐头腐败，需要更高强度的热处理才能将它们杀死，但温度过高对产品的外观、营养价值和风味都会产生不良影响，如在罐头食品中添加Nisin，可有效抑制耐热芽孢的生长繁殖，延长罐头食品的保质期。如在某些果蔬罐头食品中添加Nisin，降低杀菌强度，可有效保持果蔬罐头的组织脆度、营养风味和食用品质。

4.5 在焙烤食品中的应用

焙烤食品有蛋糕、面包、烤饼等，主要以面粉为原料，经和面、发酵、焙烤、冷却、包装而成。焙烤食品因产气菌和霉菌的繁殖多数会发生腐败变质问题，降低保质时间。很多商家为了延长保质期采用添加山梨酸钾，抽真空或气调包装，低温贮存，但是这些方法对耐热细菌如蜡状芽孢杆菌等不起作用，蜡状芽孢杆菌在焙烤食品中生长引起食物中毒的事故屡见不鲜，如在焙烤食品加工过程中添加乳酸链球菌素（Nisin）可以防止细菌的繁殖和生长，有效延长焙烤食品的保质期。

4.6 在抗菌保鲜材料中的应用

抗菌食品包装是食品包装中最有发展前景的一种包装方法，是未来最广泛应用的活性包装之一。抗菌包装材料是以生物降解的可再生高分子为载体，将乳酸菌细菌素混入一种或几种可再生高分子包装材料中，从而使其具有抗菌活性。其中的乳酸菌细菌素可从包装材料上逐渐释放到食品表面，当乳酸菌细菌素与细菌体接触时，可渗透到细胞壁，抑制其生长。因此，抗菌包装材料能杀死或抑制食品在加工、储运和处理过程中存留于表面的微生物，延长食品的货架期。而添加到包装材料中的乳酸菌细菌素则是赋予包装材料抗菌活性的关键[51-53]。在包装材料中加入乳酸菌细菌素制成抗菌包装材料，将包装材料作为活性物质的释放载体，实现活性物质（Nisin）的逐渐释放，能最大限度的保持食品的营养、风味，延长食品的货架期，抗菌包装材料在食品中的应用将有广阔的发展前景。

4.7 在饲料工业中的应用

近年来，我国畜禽养殖业发展迅速，规模扩大，饲料工业发展迅猛，如能防止致病菌对饲料的污染，就能在很大程度上遏制致病菌对动物的危害，所以，研究人员经过大量试验发现，在饲料中添加细菌素，可以防止饲料本身被致病菌污染，抑制带菌动物粪便中的病原微生物传播，还可以抑制动物肠道中病原菌的生长。

细菌素本身具有良好的性质，杀菌具有选择性、无抗药性、无毒副作用、无残留、不污染周围环境、对热稳定，在动物消化道内易被降解，不会在动物体内蓄积引起不良反应，能很好的保持饲料的营养价值和风味。饲料中添加细菌素对猪、牛、鸡、鸭等动物胃肠疾病的防治起到了积极的作用，得到越来越多人的接受和支持。

4.8 在医药工业中的应用[54-56]

乳酸菌细菌素对革兰氏阳性菌致病菌和部分革兰氏阴性菌致病菌有抑制作用，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志贺氏菌（Shigella castellani）、单孢增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（Escherichia coli）和绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）等均有抑制作用，可以治疗肠炎、胃炎等。乳酸菌细菌素能使人体胃液分泌增多，促进胃肠蠕动，加快食物消化，可以治疗因消化不良引起的腹泻、腹胀、胃肠炎等。乳酸菌细菌素能选择性的杀死肠道致病菌，改善肠道环境，调节胃肠道正常菌群平衡；乳酸菌细菌素能选择性杀死肠道致病菌，增加机体的特异性和非特异性免疫物质，促进有益菌生长的免疫调节作用。乳酸菌细菌素能刺激肠道产生免疫球蛋白，增强机体的细胞免疫，提到肠道免疫力。

5 结语

关于乳酸菌细菌素的研究主要集中在提取与分离钝化上，对其稳定性和功能性的研究方面欠缺，今后将在这些方面加大研究力度。乳酸菌细菌素目前作为食品添加剂使用，并在多种食品中成功应用。乳酸菌细菌素作为天然的功能性防腐剂具有安全、无毒、环保，抑菌谱宽、稳定性强等特色，在食品、调味品中展现出较好的开发前景。随着科技的快速进步，新技术新方法的不断研究，乳酸菌细菌素制品品质越来越高，给乳酸菌细菌素在食品工业上的应用带来新的机遇。