红景天苷通过HIF-1α/NF-κB信号通路对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征大鼠炎症的调控作用

吴格怡 黄心蔚 郑美乔 刘嘉慧

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）是一种以夜间反复间歇低氧为特征的疾病，其引起的多脏器损伤与氧化应激反应导致的炎症介质增加相关[1]，研究表明，引起这一系列反应的途径为低氧诱导因子-1α（HIF-1α）/核因子-κB（NF-κB）信号通路[2]。OSAHS的慢性间歇低氧使HIF-1α/NF-κB信号通路激活，其下游炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）增加，造成机体各种损伤[3]。红景天具有抗衰老、抗氧化应激、抑制炎症反应、增强免疫、清除氧自由基等作用。本研究旨在观察红景天苷通过HIF-1α/NF-κB信号通路对OSAHS大鼠炎症的调控作用。

1 材料与方法

1.1 试剂材料红景天苷（货号：BP1020-20mg）购自广州剪刀手基因科技有限公司，TNF-α（货号：JM-01587-R2）、IL-6（货号：JL18212-96T）、IL-8（货号：JM-04713H1-96T）、ELISA检测试剂盒均购自深圳市文乐生物科技有限公司，HIF-1α抗体（货号：YCKJ-RJ-038165）购自北京标谱检测科技有限公司，NF-κB抗体（货号：YCKJ-RJ-022161）购自广州誉嘉生物科技有限公司。

1.2 实验动物及造模购自广东省医学实验动物中心的标准雄性大鼠[许可证号 SCXK（粤）2013-0002]共56只，周龄（10±2）周，体重（230±20）g。按随机原则分为正常对照组、慢性间歇低氧组、红景天苷低剂量组、红景天苷高剂量组各9只，适应性喂养后开始造模。除正常对照组外，其余27只大鼠均放养于间歇低氧仓内，参照文献[4]中间歇低氧仓建造方法。增加仓内氮气时，仓内氧浓度下降，增加仓内氧气时，仓内氧浓度上升，间歇循环时间为8min。造模时间共8周，每天8h（9：00-17：00）。在造模的最后1周，每次入仓前，红景天苷低剂量组给予红景天苷20mg/kg，红景天苷高剂量组给予红景天苷100mg/kg腹腔注射，正常对照组、慢性间歇低氧组注射等量生理盐水，时间共7d。

1.3 取材及检测

1.3.1 取材 8周后36只大鼠均予腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心脏采血，血液静置离心后，取上清液于-80℃冷藏以备ELISA检测。大鼠处死后剪取适量肺组织，于液氮中迅速冷却，-80℃冻存以备Western blot检测。

1.3.2 ELISA检测 取冷藏上清液，样品孔中加入待测上清液，封膜，4℃过夜后洗板。室温下加入一抗，封膜后孵育1h，再洗板3次；室温下加入二抗，封膜后孵育1h，再洗板3次。显色后终止反应，450nm波长吸光度检测TNF-α、IL-6、IL-8含量。

1.3.3 Western blot检测 取冻存肺组织，清洁后液氮下磨成粉末状，加入含PMSF的裂解液冰上裂解30min。成品移入离心管，4℃下15 000r/min离心20min，吸取上清细胞裂解液，BCA法检测蛋白浓度。沸水加热5min使蛋白变性，依次配胶，上样后电泳，PVDF膜转膜，TBST洗膜5min，用丽春红染膜，检测转膜效率。5%脱脂奶粉室温封闭1h，洗膜3次。TBST按比例稀释（HIF-1α 1:1000，NF-κB 1:1000，β-actin 1:2000）后加入一抗，摇床上4℃孵育过夜，复温后TBST洗膜3次；加入1：1000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG二抗，摇床上4℃孵育过夜，复温后TBST洗膜3次。ECL发光液显影，定影液显色，底片曝光，扫描，分析结果。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比较与正常对照组比较，其余3组TNF-α、IL-6、IL-8水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与慢性间歇低氧组比较，红景天苷低剂量组和红景天苷高剂量组TNF-α、IL-6、IL-8水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与红景天苷低剂量组比较，红景天苷高剂量组TNF-α、IL-6、IL-8水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比较（±s，n=9）

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比较（±s，n=9）

注：与正常对照组相比，△P＜0.05；与慢性间歇低氧组相比，＃P＜0.05；与红景天苷低剂量组相比，*P＜0.05

2.2 各组大鼠肺组织HIF-1α和NF-κB蛋白表达比较与正常对照组相比，慢性间歇低氧组大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表达明显增加（P＜0.05），而应用红景天苷腹腔注射后，红景天苷低剂量组和红景天苷高剂量组大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表达下调（P＜0.05），红景天苷高剂量组下调更明显（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 各组大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表达比较

表2 各组大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表达量比较（±s）

表2 各组大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表达量比较（±s）

注：与正常对照组相比，△P＜0.05；与慢性间歇低氧组相比，＃P＜0.05；与红景天苷低剂量组相比，*P＜0.05

3 讨论

OSAHS是一种睡眠呼吸障碍性疾病，占睡眠呼吸疾病的70%以上[5]，其因鼻咽等上呼吸道因素导致慢性间歇低氧而引起一系列问题。由于慢性间歇低氧，体内TNF-α、IL-6等炎症因子增加，而这些因子的增加也可加重上呼吸道阻塞，导致恶性循环[6]。

慢性间歇低氧大鼠体内的多种炎症因子包括TNF-α、IL-6、IL-8等均由NF-κB调控、转录。在生理状况下，NF-κB并不表达或表达很少，与其抑制因子（Inhibitor of NF-κB，IκB）结合，为无活性状态存在于胞浆中。疾病中的物理及化学因素刺激均可导致这种结合的分离，如病毒、细菌内毒素、氧化应激反应以及OSAHS的特征性改变-慢性间歇低氧。在这些变化刺激中，NF-κB与靶基因、增强子或早期炎症反应基因再结合，TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子大量产生。TNF-α是促炎因子，并且是机体免疫应答的重要因子，其过度应答聚集了大量中性粒细胞，继而上调IL-8的表达，IL-8可进一步趋化中性粒细胞，炎症反应更加严重[7]。

在疾病的发生发展过程中，HIF-1α/NF-κB信号通路具有重要作用。HIF-1α是HIF-1的一个亚基，受缺氧信号刺激激活NF-κB信号通路经典途径[8，9]。NF-κB是一种能与许多基因启动子κB序列结合而发挥转录功能的核因子[10]。有学者认为，OSAHS患者更多是先活化NF-κB而导致整个炎症途径的激活[11]：患者机体反复发作性缺氧导致氧化应激反应，体内的活性氧（ROS）可通过有丝分裂原激活NF-κB的磷酸化途径，使IκB蛋白降解，NF-κB解离，NF-κB活化并进入细胞核，与相应DNA序列结合，激活一系列如TNF-α、IL-6、IL-8下游炎症因子，加重炎症。HIF-1α同样可以刺激炎症因子增加，OSAHS患者脯氨酰羟化酶受到抑制，HIF-1α不能完全泛素化及羟基化[12]，因此HIF-1α水平增加。而在缺氧状态下，细胞也可以通过PI3K/AKT/mTOR和Ras/MAPK等通路使HIF-1α表达增加[13，14]。同时，HIF-1α与NF-κB相互影响导致OSASH炎症的发生发展，内皮素-1（ET-1）可通过 HIF-1α激活 NF-κB途径参与 OSAHS相关血管重构[15]；而NF-κB也可以反过来激活病灶部位的HIF-1α，HIF-1α通过诱导糖酵解酶导致内皮细胞（EC）过度增殖，促进这些部位的动脉粥样硬化和炎症[16]。

红景天苷是从中药红景天中提取的主要成分，具有抗衰老、抗缺氧、抗氧化应激、保护心肺组织等多种作用[17]。本研究显示，经红景天苷腹腔注射的大鼠NF-κB、HIF-1α蛋白表达均下降，且与红景天苷的剂量有关。红景天苷可作用于OSAHS患者的NF-κB及P38信号通路，达到抗炎效果[18]，亦可使脯氨酰羟化酶活化而减少HIF-1α的产生[19]。完整的NF-κB信号通路有赖于HIF-1α的表达及调节水平[20]。根据本研究结果推测，红景天苷抑制HIF-1α的产生，并进一步抑制NF-κB的表达，从而下调TNF-α、IL-6、IL-8炎症因子的表达。

综上所述，HIF-1α及NF-κB在炎症过程中相互影响，红景天苷抑制其表达从而减少其下游炎症因子产生，达到保护OSAHS患者机体作用。而此过程中，HIF-1α/NF-κB信号通路作用机制及更多的靶因子仍有待进一步深入研究。