大棚栽培和仿野生栽培铁皮石斛正丁醇提取物体外生物活性比较*

廖娴，梁芷韵，胡莉，黄月纯，杨丽娥△

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510006）

铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）为兰科石斛属多年生草本植物［1］，具有益胃生津、滋阴清热功效，常用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热不退等病症［2］。由于其生长条件苛刻，自然产量极少，加之长期过度采挖，导致野生资源濒临绝种［3］。为解决野生铁皮石斛资源短缺问题，规模化铁皮石斛大棚栽培、人工仿野生栽培等方式作为资源可持续开发利用的新模式在国内不断发展成熟［4］。铁皮石斛栽培于浙江、云南、广西、广东、福建、贵州、四川、江西等地，但由于产地和栽培技术的不同，导致各地药材品质差异较大。研究发现，铁皮石斛最主要活性成分为多糖类成分，其在抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、保肝和保护胃肠等方面具有明显的药理作用［4-5］。目前，对大棚栽培和仿野生栽培铁皮石斛的研究侧重于其化学成分的组成和含量分析，对不同栽培方式的生物活性研究则较少。因此，本研究中评价了大棚栽培和仿野生栽培两种栽培方式下的铁皮石斛正丁醇提取物体外抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤方面的生物活性，为后期其栽培方式的选择提供理论参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：CPA225D型分析天平（德国Sartorius公司）；5424R型高速离心机（德国Eppendorf公司）；OptiMair™型超净工作台（新加坡Esco公司）；DM2500型荧光倒置显微镜（德国Leica公司）；UFE500型烘箱（德国Memmert公司）；MPR-440F型低温冰箱（日本Panasonic公司）；Epoch型全波长酶标仪（美国BioTek公司）；Forma 310型CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）；Vi-CELL XR型细胞计数仪（美国Beckman公司）；AI 800型超灵敏多功能成像仪（美国GE公司）；SBS40型恒温水浴摇床（英国Stuart公司）。

试药：DMEM培养基（批号为11965118）、RPMI-1640培养基（批号为11875119）、胎牛血清（批号为10100147）、0.25%胰蛋白酶（批号为25200056）、青霉素-链霉素（批号为15140122），均购自美国Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA，批号为A5611）、脂多糖（LPS，批号为L4391）、磷酸（批号为438081）、磺胺（批号为1117990100）、维生素C（VC，批号为PHR1008）、维生素E（VE，批号为47783）、ABTS（批号为11557）、氯化三苯四氮唑（TPTZ，批号为T1253）、总抗氧化能力试剂盒（FRAP法，批号为MAK369）、三氯化铁（FeCl3，批号为451649）、硫酸亚铁七水合物（FeSO4·7H2O，批号为12354）、叔丁基过氧化氢（t-BHP，批号为458139）、5-氟尿嘧啶（5-FU，批号为343922），均购自美国Sigma公司；一氧化氮（NO）含量测定试剂盒（批号为S0021S）、CCK-8测定试剂盒（批号为C0042），磷酸盐缓冲液（PBS，批号为C0221A），双蒸水（ddH2O，批号为ST876），均购自上海碧云天公司；硫酸、苯酚、无水乙醇均为分析纯。大棚栽培铁皮石斛和仿野生栽培铁皮石斛，经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定为铁皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo的茎。

细胞：大鼠心肌细胞H9c2、巨噬细胞RAW264.7、人肺癌细胞HepG2，均购自中国广州吉妮欧生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 提取液制备

分别称取仿野生和大棚栽培铁皮石斛50.0 g，加70%乙醇800 mL回流提取2次，每次1 h，合并滤液；挥去乙醇液，水液用正丁醇提取2次，每次150 mL，合并滤液，挥干，即得正丁醇提取物。取适量，精密称定，溶于DMEM培养基中制成质量浓度为4 mg/mL的提取物母液，经0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。后续试验以DMEM培养基稀释至所需质量浓度。

1.2.2抗氧化活性检测

ABTS自由基清除能力［6］：移取质量浓度为0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的提取液各0.1 mL，置试管中，分别加3.9 mL ABTS工作液，涡旋混合10 s，室温避光条件下反应20 min，以酶标仪测定730 nm波长处的吸光度（OD）值。以水溶性维生素C（Trolox）为参照物绘制标准曲线，提取液对ABTS自由基的清除效果以Trolox等效抗氧化能力（TEAC）值表示。分别以ddH2O和VC（终质量浓度均为0.2 mg/mL）为阴性对照和阳性对照。

FRAP总抗氧化能力［6］：移取质量浓度为0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的提取液各0.1 mL，置试管中，分别加新配的FRAP工作液0.9 mL，涡旋混合10 s，37℃避光条件下反应2 h，以酶标仪测定590 nm波长处的OD值。以FeSO4绘制标准曲线，并将OD值转化为对应的FRAP值。分别以ddH2O和VC（终质量浓度均为0.2 mg/mL）为阴性对照和阳性对照。

1.2.3 对H9c2细胞衰老的保护作用

采用CCK-8法［7］。取对数生长期H9c2细胞适量，用DMEM培养基配成1×105/mL的细胞混悬液，以每孔100μL接种于96孔板。细胞贴壁24 h后，吸出培养基，加入终质量浓度分别为25，50，100，200μg/mL的提取液，孵育2 h，吸出提取液；加入100μL t-BHP（200μmol/L）溶液，处理2 h，吸出溶液；加入新鲜DMEM培养基，继续孵育24 h。以酶标仪测定450 nm波长处的OD值，并计算H9c2细胞存活率。分别以PBS和VC（终质量浓度均为0.5 mg/mL）为阴性对照和阳性对照。

1.2.4 对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用

取对数生长期的RAW264.7细胞适量，用DMEM培养基配成5×105/mL的细胞混悬液，以每孔100μL接种于96孔板。细胞贴壁24 h后，吸出培养基，加入终质量浓度分别为25，50，100，200μg/mL的提取液，孵育24 h，收集上清液，测定NO水平。分别以PBS和LPS（终质量浓度均为10μg/mL）为阴性对照和阳性对照［8］。

1.2.5 对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

采用CCK-8法［9］。取对数生长期HepG2细胞适量，用RPMI-1640培养基配成1×105/mL的细胞混悬液，以每孔100μL接种于96孔板。细胞贴壁24 h后，吸出培养基，加入终质量浓度分别为50，100，200，400μg/mL的提取液，孵育48 h。以酶标仪测定450 nm波长处的OD值，并计算HepG2细胞增殖抑制率。分别以PBS和5-FU（终质量浓度均为50μg/mL）为阴性对照和阳性对照。

1.3 统计学处理

实验数据采用SPSS统计学软件分析。计量资料以±s表示，行独立样本t检验；计数资料以率（%）表示，行χ2检验；利用GraphPad Prism 7.0统计学软件作图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外抗氧化活性

随着提取液质量浓度的升高，TEAC值及FRAP值均逐渐升高，且呈浓度依赖性。结果表明，大棚栽培来源与仿野生栽培来源的铁皮石斛正丁醇提取物，在0.5～4.0 mg/mL质量浓度范围内，ABTS自由基清除能力及FRAP总抗氧化能力均相当（P＞0.05）。详见图1。

图1 抗氧化活性检测情况A.ABTS radical scavenging capacity B.FRAP total antioxidant capacityFig.1 Results of antioxidant activity test

2.2 对H9c2细胞衰老的防护作用

随着提取液质量浓度的升高，H9c2细胞存活率逐渐升高，且呈一定的浓度依赖性。结果表明，在25～200μg/mL质量浓度范围内，大棚栽培来源与仿野生栽培来源的铁皮石斛正丁醇提取物对t-BHP诱导H9c2细胞衰老的防护作用相当（P＞0.05）。详见图2。

图2 H9c2细胞存活情况Fig.2 Survival situation of H9c2 cells

2.3 对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用

随着提取液质量浓度的升高，RAW264.7细胞的NO释放量也逐渐增加，且呈一定的浓度依赖性。结果表明，在质量浓度分别为100μg/mL和200μg/mL时，仿野生栽培来源铁皮石斛正丁醇提取物对RAW264.7细胞NO释放的促进作用显著强于大棚栽培来源提取物（P＜0.05，P＜0.01）。详见图3。

图3 巨噬细胞RAW264.7 NO释放情况Note：*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.3 NO release from RAW 264.7 macrophages

2.4 对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

在50～400μg/mL质量浓度范围内，提取液均可一定程度抑制HepG2细胞生长，在相同质量浓度下，大棚栽培来源与仿野生栽培来源的铁皮石斛正丁醇提取物对HepG2细胞增殖的抑制作用相当（P＞0.05）。详见图4。

图4 肝癌细胞HepG2增殖抑制情况Fig.4 Inhibition of HepG2 cells proliferation

3 讨论

通过比较不同种源铁皮石斛的黄酮苷类成分特征图谱及丰度的差异，可将其区分为丹霞铁皮种、浙江本地种、云南广南种及广西铁皮兰种4种种源，且不同种源仿野生与大棚栽培的铁皮石斛品质也存在差异［10］。浙江本地种铁皮石斛在仿野生栽培、大棚栽培、纯野生栽培方式下的多糖、甘露糖、醇溶性浸出物等多种成分含量存在差异［11］。

ABTS自由基清除能力测试和FRAP法测定总抗氧化能力广泛用于评价提取物、提取部位等的体外抗氧化活性［6］。本研究中基于上述两种实验的结果，初步推断在一定质量浓度范围内，大棚栽培和仿野生栽培来源的铁皮石斛正丁醇提取物的体外抗氧化活性及效价相当。t-BHP诱导的H9c2细胞衰老模型可评价提取物抗衰老活性［7］。本研究中基于该模型的实验结果，初步推断在一定质量浓度范围内，大棚栽培和仿野生栽培来源的铁皮石斛正丁醇提取物对t-BHP诱导H9c2细胞衰老的保护作用及效价相当。肝癌细胞HepG2可初步评价提取物的抗肿瘤活性［9］。本研究结果提示，大棚栽培和仿野生栽培来源受铁皮石斛正丁醇提取物均具有一定的抑制HepG2细胞增殖的作用，且作用及效价相当。铁皮石斛可通过多途径、多层面提高机体免疫功能［6］。巨噬细胞在免疫系统的调节过程发挥关键作用，常被用于体外免疫活性的研究。巨噬细胞被激活后释放信号传导因子NO，进而参与免疫调节过程［8，12］。本研究中与大棚栽培来源铁皮石斛正丁醇提取物比较，仿野生栽培来源提取物可促进巨噬细胞释放更多的NO，故初步判断仿野生栽培来源铁皮石斛正丁醇提取物免疫调节作用相对较强。

综上所述，大棚栽培来源和仿野生栽培来源铁皮石斛正丁醇提取物体外抗氧化、抗衰老和抗肿瘤方面的活性相当；后者免疫调节能力优于前者。