乳蛋白功能特性及其分析检测技术研究进展

赵笑，白沙沙，孔凡华，徐佳佳，柴艳兵，张耀广，李兴佳，李飞，李东，崔亚娟

（1.北京市营养源研究所，北京 100069；2.北京市科学技术研究院，北京 100089；3.石家庄君乐宝乳业有限公司，石家庄 050221；4.河北君乐宝君源乳业有限公司，石家庄 050011）

0 引 言

乳蛋白是牛乳中最主要的成分，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，同时还有少量的脂肪球膜蛋白[1]。牛奶中的蛋白会因品种、个体、哺乳期等的差异而有所不同，且牛乳中主要蛋白含有多种变异体，使得同种蛋白的功能存在差异[2]。随着新的蛋白检测技术和蛋白质组学的发展，牛乳中越来越多的蛋白被发现，且其生物活性也被进一步研究[3]。但乳蛋白种类多样，结构复杂，使得不同蛋白的分离检测存在一定的难度，其检测方法依然是限制研究深入的主要瓶颈。

本文综述了乳蛋白组分的功能性及其不同分析检测方法的特点，为全面了解乳蛋白质的功能特性，提高牛奶品质，促进健康消费提供指导意义，也为今后乳蛋白的检测和应用提供借鉴。

1 乳蛋白的功能特性

1.1 乳清蛋白的功能特性

乳清蛋白是高质量的动物蛋白，主要由结构紧凑的球蛋白组成，包含8种必需氨基酸，其比例可以完全满足人体的需求。乳清蛋白其基本营养功能取决于其独特的氨基酸序列和蛋白质的空间结构。乳清蛋白含有丰富的蛋氨酸和半胱氨酸，是人体内重要的抗氧化剂；能通过消耗谷胱甘肽（GSH）而使肿瘤细胞对化疗更敏感，实现抗癌作用[4]；可促进胰岛素释放进而降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平[5]；乳清蛋白活性多肽能够增强免疫细胞功能、抑制肿瘤的生长[6]；乳清蛋白还可以应用于保健品中，实现提高记忆力的功能[7]。此外，乳清蛋白具有起泡能力、乳化特性、微胶束化、持水性、涂层性、成胶性等功能，这些独特的特性使乳清蛋白作为食品成分应用于食品工业等领域[8]。

α-La含量约占乳清蛋白的20%，分子量约为14.2 ku，由123个氨基酸组成，包含8个半胱氨酸，形成了4个二硫键[9]。该蛋白由泌乳期的乳腺上皮细胞产生，是乳清蛋白产品中的重要过敏原，经巴氏灭菌后大部分的α-La可以完整存活。牛乳中α-La的功能特性与人乳中的相似，能提供最接近母乳的氨基酸组合，促进婴儿的大脑发育，同时还可以提高蛋白质的生物利用率，降低蛋白质总量，从而有效减轻肾脏负担，因此广泛用于保健品，药品和婴儿配方食品中[10]。α-La可以与Ca2+，Mg2+，Mn2+，Na+和其他金属离子合，增强其稳定性，改变其功能和特性[11]。α-La含有丰富的色氨酸，色氨酸是神经发育的关键因素，是与食欲，情绪和睡眠调节有关的核心营养成分，还可以调节泌乳并缓解压力[12]。有关研究表明，α-La在癫痫发生的小鼠模型中显示出保护作用，减少了自发性癫痫的发生，其作用机制很可能与色氨酸的转化有关[13]。此外，α-La经蛋白酶解可产生各种活性肽，有助于矿物质的吸收，抗菌和抗肿瘤等的活性[14]。体外实验已表明含色氨酸的多肽具有广泛的生物活性，如血管紧张素转换酶（ACE）抑制以及抗氧化、抗糖尿病活性等[15]。

β-Lg含量约占乳清蛋白的60%，分子量为18.4 ku，由162个氨基酸组成，包含两个二硫键和1个SH键[16]，该蛋白由乳腺上皮细胞合成，是牛乳中的主要过敏蛋白，而在人乳中未发现β-Lg[17]。β-Lg具有增强免疫力和其它生物活性的作用[18]。β-Lg可以结合各种矿物质，脂溶性维生素、磷脂和脂肪酸，从而增强了β-Lg在体内的吸收，以及在低脂、无脂和脂溶性维生素营养保健食品中的使用[19-20]。此外，β-乳球蛋白还具有抗氧化功能，可通过抑制细胞衰老，促进成肌细胞的分化和成熟，减轻氧化应激引起的衰老相关损伤[21]。

BSA质量分数约占乳清蛋白的10%，分子量为68 ku，存在于血液中，由581个氨基酸组成，包括35个半胱氨酸，形成了17个二硫键。BSA具有与脂肪酸和其他小分子结合的疏水性分子结构，具有与β-Lg类似的功能[22]。免疫球蛋白含量约占乳清蛋白的10%，是具有抗体（Ab）活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白，具有抗氧化、提高免疫力的作用[23]。乳铁蛋白是一个80 ku的铁结合糖蛋白，牛初乳中质量浓度较高约为1～2 mg/mL，正常乳质量浓度约为0.02～0.35 mg/mL。乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大的生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂[24]。过氧化物酶是牛奶中最丰富的酶，也是乳清蛋白中的主要抗菌成分[25]。

1.2 酪蛋白的功能特性

酪蛋白具有很高的营养价值，其特定的功能性与氨基酸序列有关，由于序列中极性和非极性残基的不对称分布形成了酪蛋白分子的亲水性和疏水性区域，使酪蛋白具有良好的乳化能力和发泡性[26]。酪蛋白存在多个共价磷酸化位置，多数磷酸化基团以簇状存在，磷酸化的丝氨酸簇与钙离子牢固结合，形成了酪蛋白各种生理和营养功能的主要特征[27]。酪蛋白是多种活性肽的来源，包括阿片肽、阿片拮抗剂、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、免疫调节肽、抗菌肽肽、抗血栓形成肽和矿物元素结合肽。酪蛋白脯氨酸含量高，α-螺旋和β-折叠含量低的特点，使得酪蛋白容易被蛋白酶水解，产生多种生物活性多肽[28]。据报道，酪蛋白及其酶解产物对高浓度葡萄糖诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗具有改善特性[29]，对肝细胞HHL-5没有明显毒性而有促进其增殖的特性[30]。酪蛋白在糖尿病患者的预防和治疗方面的应用比较多，酪蛋白水解制备的抗菌肽稳定好、能抑制细菌种类多，对禽流感病毒和牛疱疹病毒也有一定的抑制作用[31]。

αs1-CN含量约占牛乳蛋白总量的38%，分子量为23 600 u，由199个氨基酸残基和8个磷酸基团组成。经酶水解产生酪蛋白磷酸肽（CPP），这些肽在体内起重要作用[32]。据报道，CPP除可增强动物的免疫力和繁殖能力[33-34]，还可以与小肠中的二价离子如钙，铁，锌，硒等结合，从而增加了离子的可溶性，促进了钙，铁，锌和硒的吸收和利用[35]。αs1-CN能够为动物体的生长发育提供活性肽、必需氨基酸等营养物质。αs1-CN可被消化酶水解以产生多种活性肽，可以调节乳腺上皮细胞等多种细胞的生理状态及功能[36]。其中23～34个氨基酸片段抑制了血管紧张素转化酶（ACE）的活性，从而促降低血压和维持身体健康[37]。αs1-CN的90～96氨基酸片段具有吗啡肽和阿片肽的作用，可调节中枢神经系统和周围神经系统的其他功能[38]。

β-CN含量约占牛乳蛋白总量的35%，分子量为24 000 u，由209个氨基酸组成，包含5个磷酸基团。β-酪蛋白具有高度疏水性，可与磷酸钙形成稳定的微胶粒，从而提高牛乳中的钙、磷含量[39]。与αs-CN相似，β-CN的15～30氨基酸片段可促进钙吸收，60～66氨基酸片段具有阿片肽活性，而177～185氨基酸片段具有ACE抑制能力和增强胰高血糖酶素的能力[40]。Nagaoka等[41]利用胰蛋白酶酶解牛乳β-Lg，从酶解液中分离出的一种5肽Ile-Ile-Ala-Glu-Lys，通过动物实验证明与β-谷甾醇（一种降胆固醇药物）相比，该肽可以显著降低小鼠血清胆固醇水平。

κ-CN含量约占牛乳蛋白总量的12%，分子量为19 000 u，由169个氨基酸残基组成，具有一个磷酸基团和两个SH键。κ-CN很容易被凝乳酶水解，主要断裂位点在在105位苯丙氨和106位的蛋氨酸。κ-CN的1～105片段可促进人杂交瘤细胞（HB4C5）中免疫球蛋白的产生[42]，106～169区段为长糖肽链，包含多个糖链，不同的糖链会产生不同的抑制活性肽，在脂多糖（LPS）存在的情况下部分抑制小鼠B淋巴细胞的分化和增殖[43]。

αs2-CN含量约占牛乳蛋白总量的8%～11%，分子量为25 150 u，由207个氨基酸组成，包括10～13个磷酸盐基团和两个巯基（SH）键，在酪蛋白中磷酸化程度最高[44]。由于蛋白磷酸化程度与矿物螯合亲和力之间有直接关系，αs2-CN相比于其它酪蛋白组分，有更高的矿物质螯合能力[45]。牛奶中γ-CN含量非常低，是由β-CN部分降解而产生的。因此，γ-CN的某些生物学特性类似于β-CN[46]。

2 乳蛋白检测技术

2.1 高效毛细管电泳法

毛细管电泳（capillary electropho resis，CE）也常称高效毛细管电泳（high performance capillary electro.phoresis，HPCE），是以内径20～200 μm的柔性毛细管柱作为分离通道、以高压直流电场为驱动力，对各种小分子、大分子以及细胞等进行高效分离、检测或微量制备等的有关技术的总称。毛细管电泳因其灵敏度高、快速、自动化高等优点被广泛用于蛋白的分析[47]。Clément等[48]采用未涂层毛细管对澳大利亚本地和进口的羊乳制品中的乳蛋白的多态性进行研究，4种主要的酪蛋白成分（αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN）和2种乳清蛋白（α-La、β-Lg）均能很好地分离。但该方法由于进样量少，毛细管直径小，因而制备能力差，用一些检测方法（如紫外吸收光谱法）时，灵敏度较低；且电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性。

2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）。非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。SDS-PAGE是蛋白分析常用的电泳法，耗时长，重现性较差。不同浓度的胶迁移出不同长度的蛋白条带，对于聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度越大分离蛋白分子量越小。分离胶浓度太大，分子量大的蛋白分不开，分离胶浓度太小，分子量小的蛋白分不开。虽然其它技术的灵敏度高又可靠但实际操作繁琐，随身携带不方便，在实地检测时电泳法比较理想[49]。目前可在电泳技术的基础上进一步提高检测的灵敏度以及研发检测试纸，提高检测的效率。该技术多用于新型蛋白的初步鉴定和不同蛋白的差异分析，如常用的乳蛋白掺伪分析。宋宏新等[50]运用SDS-PAGE法对5种市售婴幼儿奶粉进行鉴定，表明该法能较快速准确地表征乳蛋白组成，为乳及乳品质量的监控提供了一种直观有效的手段。

2.3 层析法

层析法是分离蛋白质的通用方法。其原理都是通过蛋白质在流动相和固定相之间的性质不同而达到分离的效果。层析法可分为纸层析法，凝胶过滤层析法，离子交换层析法等。凝胶过滤层析法是最为常用的，在分离蛋白质时只需要把蛋白质混合液加到凝胶柱的上部，并加少许洗脱液来产生一定的液压使蛋白质能向下运动，在凝胶柱底部用试管接流下来的蛋白质液体。王瑞雪[51]等以驼乳和牛乳的乳清蛋白为原料，经胃蛋白酶水解后，超滤后通过葡聚糖凝胶层析（Sephadex G-25脱盐柱）对其水解物进行分离纯化，得到较高纯度的抑菌肽。赵玉娟[52]等采用Sepha.dex G-75和DEAE离子交换层析对硫酸铵沉淀法得到的牛乳乳清中的主要成分α-La和β-Lg进行分离纯化，所获得的α-La和β-Lg样品纯度达到85%。此种方法简单，不需要贵重仪器，但分离的蛋白质不是很好，这些液体仍然是很多蛋白质的混合液，通过紫外吸收来确定目的蛋白的含量的最高值，因此，这种方法只能对蛋白质进行一些粗筛。

2.4 双向电泳法

双向电泳（two-dimentionlal gel electrophoresis，2-DE）广义的定义是将样品进行电泳后，在其直角方向再进行一次电泳。但是目前双向电泳大多是指第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），平衡后第二向为SDS电泳。样品中的蛋白根据电荷和质量两次分离后，可利用得到分子的等电点、分子质量等信息。分离的结果不是带而是点，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。双向电泳技术特别是以固定向pH梯度等电聚焦为第一向的双向电泳技术，是当前分辨率最高，信息量最大的电泳技术。为了可更全面的分析乳蛋白组分，该方法多与其它方法同时使用。Galvani等[53]采用2-DE和MALDI-TOF-MS对市售牛奶粉进行了研究，采用了pH 3～7和pH 4～72种规格的IPG胶条，分析了9种酪蛋白和一些单磷酸化/多磷酸化修饰的蛋白和糖结合蛋白。Hogarth等[54]采用蛋白质组学技术研究了临床乳房炎牛乳中蛋白成分的变化，以达到识别乳房炎的诊断标记，采用2-DE分析了乳房炎牛乳的乳清蛋白和健康牛乳的乳清蛋白。

2.5 高效液相色谱法

高效液相色谱法是分析乳蛋白成分的有效方法之一，与其他检测方法相比具有分辨率和回收率高、操作简便、重复性好等优势。高效液相色谱法可以高效实现大分子以及复杂物质快速分离，对乳品中蛋白质进行定性定量检测[55]。目前该方法在乳蛋白分离中的应用最为广泛，Gerd Bobe等[56]采用C18反相柱研究实现了牛乳中6种主要蛋白的快速分离和定量分析，同时也研究了κ-CN、β-CN和β-lg的遗传变异体。Bonfatti等[57]用C8反相色谱柱探讨了分离和定量分析牛乳主要蛋白的遗传变异体，除αs1-CNB和αs1-CNC外，其他酪蛋白和乳清蛋白的变异体在40 min内都能很好地分离。缪淑颖等[58]采用高效液相色谱法检测牛乳中6种主要乳蛋白的多态性。研究发现，酪蛋白中αs2-酪蛋白存在A型和B型两种类型，β-酪蛋白存在A1，A2，B，C和F，5种类型，κ-酪蛋白存在A/E型和B型两种类型，而αs1-酪蛋白仅有1种，未发现其多态性；乳清蛋白中，β-乳球蛋白存在多态性，有A、B和C 3种类型，但未发现α-乳白蛋白的多态性。Bonfatti等[59]采用反相高效液相色谱方法成功地应用于水牛乳的分离和定量分析。所有最常见的水牛酪蛋白和乳清蛋白组分，以及它们的遗传变异，在40 min内被同时检测和分离，纯化的水牛乳蛋白被用作校准标准。尽管该方法的应用较为成熟，但使用该方法测乳蛋白时也存在一些不足，如流动相的变化，蛋白的扩散或滞留等会导致色谱峰的加宽，柱效降低，使得测定结果不准确，因此液相色谱柱需要及时清洗。

2.6 高效液相色谱串联质谱法

该方法利用质谱定量思路的靶向蛋白质组学技术，利用蛋白专属的肽段序列完成定量分析，通过采用碱性胰蛋白酶为酶切工具，利用其高度专一性，水解精氨酸与赖氨酸羧基端的肽键，烷基化与酶解乳蛋白类原料。通过Uniprots数据库的PeptideMass工具分析，乳蛋白通过酶解获得的多肽产物，从质谱系统的检测性和稳定性上考虑，应选择特定氨基酸上修饰少，色谱分离过程中无干扰、响应值高，长度6～12个氨基酸的多肽作为目标肽段[60]。在应用高效液相色谱串联质谱法检测多肽时，多肽的响应值受到基质以及参与反应的化学试剂的影响，导致响应信号增加或抑制。基于上述问题，可以选择同位素特异肽作为内标，在预处理之前加至被测样品中。同位素特异肽的理化性质与目标多肽完全一致，色谱-质谱行为也一致，能校正由基质效应所带来的检测响应值波动。选用同位素标记内标肽段不但能降低基质效应还能校正样品前处理过程的误差。

陈柔含等[61]建立了超高效液相色谱-串联质谱技术定量检测乳制品中牛乳铁蛋白含量的方法，实现了乳铁蛋白及其肽段的鉴定，考察了空白基质匹配的外标法和内标法对乳铁蛋白检测结果的差异。采用外标法定量时，平均回收率为93.8%～103.9%。Le等[62]利用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），采用多反应监测模式（MRM）从662种丹麦荷斯坦奶牛生牛奶样品中，同时检测和测量两大牛奶目标蛋白质α-La和β-CN。检测结果显示，每头奶牛的α-La和β-CN的质量浓度分别为0.5～1.9 g/L（平均1.1 g/L），7.5～23.4 g/L（平均15 g/L），检测限（LOD）分别为0.14 g/L和0.16 g/L，重现性＜15%。总的说来，该方法简便易行、定量准确、精密度好，能满足乳蛋白类样品中不同蛋白质含量的检测要求。

3 结果与展望

本文对乳蛋白的蛋白组成包括乳清蛋白中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶等和酪蛋白中的αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白等的含量、分子量、氨基酸组成特点以及相关肽段位置和具有的功能活性进行了概述。进一步说明乳蛋白中含有不同功能活性的肽段，且功能活性与肽段的氨基酸组成密切相关。此外，对不同乳蛋白的检测方法包括高效毛细管电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、层析法、双向电泳法、高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法的分离原理与分离效果进行了总结。表明不同乳蛋白组分的分离可根据分离条件和要求选择不同分离方法，其中高效液相色谱串联质谱的方法分离乳蛋白，因其简便、快速、准确性高等的优势，日渐成为常用的分离乳蛋白的方法。总之，乳蛋白是牛乳中的重要成分，在人体的营养健康方面起着至关重要的作用。

随着人们对乳蛋白需求在不断增长，保持健康、增强机体免疫力以及促进身体恢复的动力需求等，推动人们对于乳蛋白产品的购买，因此也推动了乳蛋白检测技术的创新及功能性乳蛋白的开发。尤其在新冠疫情的影响下，人们对于营养的研究更为重视，其中就包括对于乳蛋白的研究，由于乳蛋白具有的抗癌、抗炎症、提高免疫力等的功能，因此很有可能在抵抗新冠病毒感染方面起到一定的作用。虽然很多研究已经证实乳蛋白及其水解物可以用于保健食品的开发，但实际产品仍有限，因此进一步开发乳蛋白为基础的功能性食品仍具有很大的发展前景。分离提取技术的单一和乳蛋白及其水解肽高昂的生产成本可能是限制乳蛋白发展应用的主要原因。随着研究的深入及乳蛋白分离提取工艺的成熟，乳蛋白及其水解物的生物活性必会被充分开发与利用，其产品在国内市场也必有广阔空间。因此，在乳清蛋白和酪蛋白已有的分离分析技术上，继续扩大检测技术的应用，缩短检测时间，拓展开发新型功能蛋白、重视其多肽产品开发以及继续深入开展其促进人类健康的机理、机制研究，均是我们未来研究和产业发展的方向。