浅析口蹄疫阻断ELISA 试验中易出现的问题及其纠正措施

徐振浩，王岩梅

（山东省青岛市即墨区动物疫病预防与控制中心，山东 青岛 266200）

ELISA 试验是目前基层兽医实验室经常使用的检测方法，常用于口蹄疫、猪瘟等疫病的抗体效价测定，以及口蹄疫病、猪瘟等疫病的流行病学的调查、疫病诊断、防疫检测、免疫程序制定等工作中。该试验操作要求取量精确，操作熟练，读数及时，试验环境温度适宜恒定，仪器设备计量准确等。在试验操作过程中，稍有失误就会使试验结果出现偏差，试验数据不准确或试验失败。笔者通过长期的检测工作，总结了试验中易出现的问题，并提出纠正措施，供实验室人员参考。

1 人员方面易出现的问题

1.1 操作人员技术水平低

实验室未按照人员培训程序要求进行岗前操作技能的培训，导致在试验中试剂取量不准确，容易导致监测数据不准确或试验失败。

1.2 对实验操作规程不熟练

操作人员不熟练掌握ELISA 检测试剂盒说明书，不能精准掌握反应时间，易出现检测结果的不准确。

2 仪器设备方面易出现的问题

常见移液器和酶标仪不检测校准或酶标仪读数错误。ELISA 试验取样微量，要求取量精确、移液器和酶标仪仪器精准、计量精确，试验结果才能准确，否则难以确保试验结果的准确性。

3 操作过程中易出现的问题

3.1 加样过程常出现的问题

（1）每次加不同标本时不更换枪头，易发生交叉污染。（2）加样时速度太快，将标本加在孔壁上部或溅出或产生气泡。（3）为了防止操作时差对结果的影响，使用血清稀释板先把血清稀释好，再转移到检测板子中，加样时对稀释后的血清不吹打混匀。（4）在加酶结合物和显色液时，由于检测样品过多且使用单道移液器，造成加样间隔时间过长，使加液过程不能迅速完成。

3.2 温育过程常出现的问题

3.2.1 温育板上不加盖 抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育。温育过程在ELISA 检测中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。温育常采用的温度有43 ℃、37 ℃、室温等。37 ℃ 是实验室中常用的温育温度，为避免蒸发，板上应加盖或用塑料贴纸覆盖板孔（FMD-3ABC 和CSFV 试剂盒）。在试验操作过程中往往板上不加盖。

3.2.2 反应板叠放 温育过程中，若要求室温温育，则一般是指20～25 ℃。室温温育中经常出现将反应板叠放现象，将难以保证各板的温度都能迅速平衡。

3.3 洗涤过程常出现的问题

3.3.1 洗涤次数不按说明书要求 洗涤目的是去除反应体系中与反应无关的成分、未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤时不按照说明书要求洗涤次数进行洗涤。

3.3.2 洗涤操作不规范 洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，无论洗板方式如何，洗涤操作应规范，在向板孔内注液时出现气泡残留孔内，因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。

3.4 显色过程常出现的问题

显色是 ELISA 中的最后一步温育反应，在以HRP 作为标记酶的ELISA 试剂盒中，主要采用TMB 和OPD 两种底物，其中以TMB 最为多见，TMB 底物显色一般要求室温，如果升高或者降低反应温度均可影响检测结果。为了保证结果的稳定性，必须固定显色时间和温度，但不少操作者往往忽略了这一点。

3.4.1 出现反应板显色淡，灵敏度偏低的原因（1）试剂盒在运输途中时间太长或环境温度太高。（2）试剂盒取出未充分平衡。（3）试剂盒以前使用过，使用次数过多。（4）使用了错误的标记物。（5）试剂失效或不同批号的试剂混用。（6）实验室检测环境温度低或恒温箱温度不足37 ℃，温育时间不足。（7）样品保存时间过久或被反复冻融过。（8）洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长，洗涤次数增加洗涤液配制不正确或使用了错误的洗涤液。（9）移液器吸液量不足，吸头内壁挂水太多或内壁不清洁。（10）底物作用时间不足。

3.4.2 出现反应板背景深，非特异性反应偏多的原因 （1）洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留，样品被污染。（2）实验室的温度过高，培养箱温度超过37 ℃或温育反应时间过长。（3）不使用一次性吸头，吸头重复使用未洗净或消毒不彻底。（4）稀释用的蒸馏水被污染。（5）底物变质或不同批次的试剂混用。（6）加样时间太长，导致实际反应时间延长。

3.4.3 出现白板，阳性对照不显色的原因（1）显色液变质。（2）洗涤液配制有误。（3）忘记加酶结合物或某个底物液。（4）终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用。

4 应采取的纠正措施

4.1 人员方面

（1）实验室应开展ELISA 试验操作的培训，使每位实验操作者能够熟练掌握检测方法，熟悉检测试剂盒使用说明书，避免操作的失误。（2）实验室应做好年度质量控制计划，及时开展人员比对活动，提高实验员的操作技能。（3）实验室定期开展能力验证计划，及时进行有能力实验室之间比对或参加业务上级开展的实验室比对活动，来提高实验室检测水平。

4.2 仪器设备方面

（1）实验室应严格按照仪器设备管理程序要求，认真按照仪器设备操作规程操作，定期做好设备的维护。（2）应按照仪器设备检测和校准计划，定期将计量设备移液器和酶标仪送到有资质的计量单位进行校准。（3）有条件的实验室可采购多台仪器设备，期间可按质量控制计划进行仪器设备或实验室间的仪器设备结果比对，验证仪器设备的准确性。

4.3 试验操作方面

（1）试剂盒在运输途中尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温。（2）实验前试剂盒从2～8 ℃ 冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20 min，确保所有试剂已平衡至室温（约25 ℃）。（3）试剂盒使用前应仔细查验，查看试剂盒从冰箱里拿出的次数，查看试剂盒是否曾在外界某个地方或极低的温度下太长的时间。（4）为确保使用的标记物来自试剂盒和批次是特异性的，避免每次倒出的试剂下次再使用或倒回原瓶，不要过早的将标记物倒出。试剂失效或不同批号的试剂不能混用。（5）试剂盒使用后应将使用过的板条及时废弃，以免下次重复使用，未使用过的包被板，切记勿撕开上面的封膜。（6）应保持室内温度在20～25 ℃ 内，避免在热源、直射光照下或通风口旁边操作。按试剂盒规定的时间温育，准确定时，不能过长或过短。调整恒温箱温度，使恒温箱温度保持37 ℃，避免温度过高或过低，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定。（7）样品应新鲜采集，低温保存，应避保存时间过久或被反复冻融过，血清样品应避免溶血。（8）校正移液器，吸头要配套，尽可能使用一次性的，装吸头时要紧密，保证吸头内壁清洁，避免移液器吸液量不足或吸头内壁挂水太多。（9）确保使用试剂盒配置的洗涤液，标明洗涤液以免误用，每次加液前均应看清各试剂的标签，避免洗涤次数增加、洗涤液配制不正确或使用了错误的洗涤液。浓缩洗液配制要准确，如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释，充分洗涤，彻底拍干。加酶标记物后拍干用的滤纸不要反复使用，避免造成污染，注意不要漏加和忘记加酶结合物。（10）使用新鲜蒸馏水，避免稀释用水被污染。（11）洗涤时按说明书要求的浸泡时间和洗涤次数进行洗涤，避免冲击力太大、浸泡时间过长。合理安排试验，如果一次试验的样品量过多，可采用多道移液器或多人试验，尽可能避免加样时间太长。（12）底物和显色液应避光保存，底物溶液使用时应现用现配。底物在加到检测板之前，应检查是否变蓝，如出现变质，弃去不用。（13）终止液不能作洗涤液稀释或当底物液使用，底物显色终止后，尽量在30 min 内进行酶标板读值。酶标仪读数前应检查波长是否正确，检验酶标仪的校正和对准灯。