补肾中药改善高龄不孕女性卵母细胞氧化应激损伤的研究进展

李秀芳 王忠清 朱 蕾 张小平 徐海燕 连 方

(1 山东中医药大学第一临床医学院，济南，250000； 2 山东大学附属生殖医院，济南，250021； 3 山东中医药大学眼科与视光医学院，济南，250000； 4 济南金龄健康护理院，济南，250000； 5 空军济南基地保障部门诊部，济南，250002； 6 山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心，济南，250000)

近年来，随着社会的发展、工作和生活压力的增大，女性生育年龄逐渐增大。35岁以后生育第1个孩子的比例从1970年的1/100增加到2006年的1/12[1-2]。而年龄与卵巢储备功能密切相关，可作为预测女性生育能力的一个独立因素，女性在35岁以后生育力明显下降[3-4]。随着二胎政策的放开，中国有9 000万对夫妇符合生育条件[]，其中60%为35岁以上高龄女性[5-7]。这部分女性卵巢储备功能下降，临床妊娠率低，如何提高高龄不孕女性的生育力是关系国计民生的重要问题。

目前，35岁以上高龄不孕女性，选择辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)治疗的高龄不孕女性数量在世界范围内迅速增长[8-9]。但其助孕结局往往并不理想。国外有研究表明，35岁以上女性在体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer,IVF-ET)周期中，胚胎种植率开始下降，每增加一岁，胚胎种植率降低2.77%，年龄超过44岁的女性胚胎种植率只有2.3%[10]；同时临床妊娠率急剧下降，自然流产率升高[11]。高龄不孕女性窦卵泡数减少，卵母细胞质量下降，IVF-ET周期中使用大量外源性促排卵药物，反复刺激卵巢，可诱导氧化应激反应，降低卵母细胞质量[12]。卵母细胞质量是影响妊娠成功的关键因素，并随着年龄的增长而下降。为解决这一难题，生殖医师在临床实践中采用多种策略来提高卵巢反应，比如添加辅酶Q10、脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)、生长激素(Growth Hormone，GH)等，但研究结果尚有争议。补肾中药作为中医学的重要组成部分，大量研究表明，在高龄女性IVF-ET周期中，补肾中药能够改善卵母细胞质量，减少促性腺激素(Gonadotropins，Gn)用量，提高正常受精率及优质胚胎率，改善高龄不孕女性的临床妊娠结局[11-36]。推测可能与补肾中药改善高龄女性卵细胞氧化应激损伤、抑制颗粒细胞凋亡有关，但是其确切机制尚不十分清楚。

1 高龄不孕与氧化应激关系的研究进展

高龄女性的生育能力急剧下降与卵母细胞数量和质量下降密切相关。女婴在出生时卵巢中有100万～200万个卵母细胞，此后不再产生新的卵母细胞，相反会不断丢失。有研究表明，在青春期，卵母细胞的数量已经减少到10万～30万，到了30岁后期，特别是35岁以后，卵母细胞的数量减少更加明显[17]。尽管卵母细胞数量和质量下降的原因比较复杂，但氧化应激的影响已引起越来越多的关注，普遍认为体内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)引起的氧化应激可导致高龄女性的卵母细胞线粒体功能障碍。有报道称，衰老引起的抗氧化功能下降与卵母细胞质量下降有关[18-19]。

氧化应激是指ROS产生过多，超过了机体的抗氧化防御水平，造成的一种氧化与抗氧化失衡状态，从而引起组织与细胞损伤的现象[20-21]。在生理状态下,90%的ROS来源于线粒体氧化磷酸化过程[22]。ROS在生殖过程中具有重要作用，影响卵母细胞的生长、发育和成熟以及排卵、受精、胚胎着床和胚胎发育[23]。在排卵过程中，由于黄体生成素(Luteinizing Hormone，LH)的升高以及卵泡内新生血管的形成，血管内皮细胞会产生大量的ROS，这为卵母细胞成熟和卵泡破裂提供了必要的条件。然而，过量的ROS会引起细胞损伤。作为一种对抗ROS的防御机制，卵泡和卵母细胞内存在抗氧化酶和抗氧化剂，使卵母细胞免受氧化应激的损伤，其中酶类抗氧化剂包括过超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、氧化氢酶(Catalase，CAT)、还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathion Peroxidase，GSH-Px)等；非酶类抗氧化剂包括维生素C、维生素E、GSH、类胡萝卜素、褪黑素等[2-25]。如果ROS水平与抗氧化系统不平衡，容易使卵母细胞和颗粒细胞受到氧化应激的破坏，影响卵母细胞质量。氧化应激在女性生殖系统的生理、病理过程中起着重要作用，是引起女性生殖功能下降的重要因素。

1.1 氧化应激与卵母细胞质量下降 氧化应激是高龄女性卵母细胞质量下降的主要原因[26]。氧化应激可能是卵母细胞衰老和生殖疾病的“始发者”，是引起卵泡异常闭锁、减数分裂异常、受精率降低、胚胎发育延迟的主要原因[27]。线粒体与卵母细胞质量下降密切相关，在卵母细胞线粒体内含有一套自己独有的遗传体系，称为线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)。有研究指出，衰老会引起mtDNA的氧化损伤，mtDNA拷贝数不足会造成卵母细胞发育潜能降低[28]。mtDNA拷贝数与年龄及卵巢储备关系密切，卵巢储备差的高龄女性mtDNA拷贝数显著下降[29-31]。根据生殖衰老理论，高龄女性的卵母细胞质量下降是由线粒体端粒缩短引起的，ROS水平过高可引起不同类型的端粒DNA损伤，引发(局部端粒)单链断裂(Single-strand Breakage，SSB)，影响端粒上端粒重复RNA(TElomeric Repeat-containing RNA,TERRA)的转录或保护蛋白的结合，导致端粒缩短，造成卵母细胞质量下降[32-34]。

线粒体功能障碍是卵母细胞衰老的焦点[35]。Jönsson等[36]研究发现，当氧化还原反应发生时，线粒体中的电子通过呼吸链的复合物Ⅰ、Ⅲ转移给氧，使氧化磷酸化活性增强，ROS产生增加。由于mtDNA结构的特殊性，当ROS过高时，容易与mtDNA结合，导致突变，引起线粒体功能障碍，影响电子传递链，发生电子泄露，与氧分子结合生成大量的ROS，造成恶性循环，导致卵母细胞损伤及线粒体自噬，不能产生足够的腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)，影响卵子和胚胎发育。

氧化应激可导致高龄女性胚胎发育不良，临床妊娠率降低[37-38]。高水平的ROS是IVF-ET失败的主要原因[39]。卵泡液中颗粒细胞ROS高的患者，获得卵子的概率较低，同时胚胎种植率也较低[40]。Carbone等[41]发现高龄女性卵泡液中的CAT及SOD水平明显低于育龄期女性。温灿鑫等[42]研究发现高龄女性卵泡液ROS增加、SOD活性降低，颗粒细胞中CAT及GSH水平显著降低，并且卵泡液的SOD活性影响卵母细胞质量以及受精率，最终影响胚胎发育潜能及囊胚形成。Al-Saleh等[43]研究发现，卵泡液中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量越高，对颗粒细胞DNA的损伤就越严重；而CAT可清除卵泡液中ROS，具有抗氧化作用，卵泡液中CAT水平增加，提高了受精率，增加了活产率，对IVF-ET临床结局产生积极影响。

1.2 氧化应激与细胞凋亡 ROS水平升高可能会引起DNA、RNA、碳水化合物、蛋白质和脂质氧化，从而造成不可修复的细胞损伤，导致细胞凋亡[44]。细胞凋亡在机体内环境的维持和多个系统的发育中发挥重要作用，受B细胞淋巴瘤2(B-cell Lymphoma-2，Bcl-2)家族和胱天蛋白酶家族等多个基因的严格调控。Bcl-2家族蛋白是通过调节促凋亡与抗凋亡之间的平衡来维持线粒体完整性的一类关键蛋白[45]。Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-Associated X,BAX)可通过增强线粒体膜通透性，改变跨膜电位，从而促使线粒体内细胞色素C释放到细胞质中，引起半胱氨酸天冬氨酸酶的级联反应，最终导致胱天蛋白酶-3被激活，引发细胞凋亡[46-48]。Bcl-2蛋白可以通过抑制凋亡蛋白引发的一系列信号激活发挥抗凋亡作用[49-50]。氧化应激可引起颗粒细胞凋亡，导致17β-雌二醇(Estradiol，E2)水平降低，排卵率降低，影响卵母细胞质量[51]。氧化应激介导的颗粒细胞凋亡减少了颗粒细胞-卵母细胞之间的联系，从而减少了卵母细胞的营养供应，进一步影响卵母细胞的质量[52]。Lee等[53]报道颗粒细胞凋亡与年龄有关，高龄IVF-ET患者颗粒细胞的凋亡率高。有研究结果显示，颗粒细胞的ROS水平和凋亡率都对IVF-ET的妊娠结局产生不利影响，二者在未妊娠组的表达水平要明显高于妊娠组[54]。

细胞凋亡主要有3种途径：线粒体介导的内源性凋亡途径、死亡受体介导的外源性凋亡途径以及内质网介导的凋亡途径。其中线粒体介导的内源性凋亡途径是氧化应激引起卵母细胞凋亡的重要途径[55-56]。研究表明,氧化应激是导致卵母细胞和颗粒细胞凋亡的关键因素，过高的ROS激活线粒体介导的细胞凋亡信号通路,诱导颗粒细胞凋亡,导致卵母细胞闭锁[57-59]。卵母细胞凋亡的实质就是细胞内氧化系统与抗氧化系统之间动态平衡被打破的结果。

2 补肾中药在减轻氧化应激损伤中的研究进展

2.1 理论基础 中医学认为，肾主生殖，肾气由盛转衰贯穿于女性由年轻至衰老的全过程。《素问·上古天真论》云：“女子七岁，肾气盛，齿更发长。二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕。六七，三阳脉衰于上，面皆焦，发始白。七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”由此可见，女子自五七开始，阳明脉气由盛转衰，天癸开始衰竭，身体功能尤其是生殖功能开始减退，机体呈现“肾虚”的生理状态，这与西医学的高龄定义是一致的。在IVF-ET超促排卵的过程中，多个卵泡同时生长发育，肾必然分泌大量的肾精与天癸，导致肾气一时性的旺盛，从而引起人体肾阴(肾精)、肾气的耗损，在高龄女性中尤为突出。

肾是通过“肾-天癸-冲任-胞宫”轴来实现对女性生殖功能的统摄作用的，罗元恺教授首次提出了此理论，认为肾气、天癸、冲任是与女性生殖关系最密切的物质，它们对女性的生长发育、生殖衰老起着非常重要的作用[60-61]。中医的生殖轴与西医学的下丘脑-垂体-卵巢轴虽分属不同的理论体系，但是它们的调节机制大致是相同的。许润三认为中医的肾气相当于西医学的下丘脑，主宰着天癸、冲任；天癸相当于垂体；冲脉相当于卵巢，冲脉为血海，冲脉盛衰与血海盈虚关系密切，调控着月经的来潮；任脉主胞胎，为妊养之本，相当于子宫[62]。连方教授提出了“卵巢为奇恒之脏”，按照中医藏象理论，卵巢是实体脏器，在形态上与五脏相似，具有奇恒之脏的特征[63]；而在功能上，与六腑类似，具有藏、泄双重功能。卵巢周期性的长卵、排卵过程，对应了奇恒之脏的藏、泄功能，长卵为“藏”，排卵为“泄”。卵巢藏泄有时，女子生殖周期正常，方能孕育胞胎。卵巢的藏泄功能依赖于肾的统摄作用。肾中精气充盛，天癸泌至有常，卵泡才能正常生长、排出，女性的生殖功能才能实现。但是高龄女性往往呈现肾中精气不足的状态，天癸泌至失司，冲任血海亏虚，不能滋养胞宫，影响胞宫的胎孕功能，而不能摄精成孕。因此，在临床上，补肾中药可用于治疗高龄女性不孕症，提高高龄女性的怀孕率。李丽等[64]通过补肾法对高龄女性IVF-ET妊娠结局影响的Meta分析，发现补肾法能增加高龄IVF-ET女性获卵数和人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，hCG)水平、改善子宫内膜厚度、降低子宫血流阻力指数，从而提高临床妊娠率。

2.2 补肾中药的抗氧化作用

随着抗氧化机制研究的不断深入，补肾中药在抑制细胞凋亡、改善氧化应激方面的作用受到了越来越多的关注，临床工作者对单味中药提取物(包括补肾阴中药、补肾阳中药)和中药复方抗氧化作用开展了诸多研究。

2.2.1 补肾阴中药 在补肾阴中药中，高龄IVF-ET患者使用最多的是熟地黄，熟地黄味甘、微温，归肝、肾经，功效滋阴养血，补精益髓，为补血与滋阴之要药[64]。现代药理学研究表明，熟地黄含地黄素、地黄苷、氨基酸、梓醇、糖类以及多种微量化学元素，具有抗氧化、抗衰老及促进造血、抗疲劳、增强免疫力的作用[65]。秦亚东等[66]研究发现白芍具有抗氧化功能，研究者给小鼠颈背部注射D-半乳糖后，发现模型小鼠血清中抗氧化物SOD、GSH的表达明显下降，而MDA的表达水平上升，提示存在氧化应激；给予白芍多糖治疗后，衰老小鼠血清中SOD、GSH活性升高，同时MDA的活性显著降低。当归具有补血活血的功效，其提取物当归多糖对体内自由基有较强的清除能力，能够调控SOD和GSH-Px活性，对H2O2诱导的小鼠细胞氧化应激损伤有保护作用，具有抗炎和抗凋亡作用[67]。鄂志强等[68]将从石斛中提取的生物碱-石斛碱(Dendrobine，DNE)作为抗氧化剂添加到小鼠卵母细胞体外成熟培养基中，结果发现DNE可显著降低小鼠卵母细胞的ROS水平，提高小鼠卵母细胞的GSH水平，改善氧化应激，提高卵母细胞质量。由此可见，补肾阴中药在抗氧化中发挥着重要作用。

2.2.2 补肾阳中药 补肾阳中药在生殖系统中的作用主要是性激素样作用，补肾阳中药大多具有抗氧化、延缓衰老的作用。李利娟等[50]研究发现，菟丝子总黄酮能够通过增加抗凋亡因子Bcl-2表达，降低促凋亡因子的Bax和胱天蛋白酶-3表达，减轻丙烯醛诱导的小鼠生殖细胞的损伤，发挥抗凋亡、抗氧化的作用。赵岩等[69]通过对管花肉苁蓉不同部位的药理研究发现，肉苁蓉中含有丰富的多酚、三萜、多糖、苯乙醇苷类等生物活性物质，对自由基具有较强的清除能力和抗氧化作用，且不同部位的抗氧化能力强弱顺序为根部>中部>顶部。刘春红等[70]研究发现鹿茸提取物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2，2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid，ABTS]自由基的能力较强，线虫饲喂鹿茸提取物后能显著延长其在氧化应激条件下的生存时间，延长寿命，提高生殖能力，具有抗衰老作用，且发现抗氧化作用可能与线粒体信号通路有关。发酵巴戟天中含有丰富的多糖、寡糖与蒽醌，三者对ROS自由基均有较强的清除能力，复配具有协同抗氧化作用，提示巴戟天可延缓衰老，延长寿命[71]。马蔚蓉和谈勇[72]通过雷公藤苷灌胃构建小鼠卵巢早衰模型，发现模型小鼠原始卵泡、窦卵泡、成熟卵泡、黄体数量下降，血清中SOD、CAT水平降低，颗粒细胞中ROS水平上升，核因子E2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor 2，Nrf-2)、血红素氧化酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)蛋白和mRNA表达降低，表明存在氧化应激。金丝桃苷(可从菟丝子中提取)治疗4周后，窦卵泡数和黄体数增加，血清中SOD、CAT、E2和抗米勒管激素(Anti-Müllerian Hormone，AMH)水平上升，颗粒细胞中ROS水平降低，氧化应激因子(Nrf-2、HO-1)和抗凋亡因子磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphorylated Phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated Protein Kinase，p-AKT)、Bcl-2表达升高，凋亡相关因子Bax和胱天蛋白酶-3表达下降，表明金丝桃苷具有抗氧化、抗凋亡作用，抑制早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency，POI)小鼠卵巢颗粒细胞凋亡，一定程度上修复了卵巢氧化损伤，改善了卵巢功能。

2.2.3 中药复方 中药复方在抑制颗粒细胞凋亡、减轻氧化应激损伤方面发挥着重要作用。滋肾育胎丸可降低卵巢储备功能减退(Diminished Ovarian Reserve，DOR)模型大鼠Bax表达水平，增强Bcl-2的表达，抑制颗粒细胞凋亡，防止卵泡过度闭锁[73]。刘慧萍等[74]研究发现，补肾活血方通过抑制Fas、FasL基因的表达和提高E2水平，降低LH、FSH的水平，从而抑制卵泡颗粒细胞的凋亡。王玲[75]通过对经方左归丸的研究发现，左归丸可以通过抑制抗透明带抗体的产生和抑制Fas介导的卵泡细胞凋亡使自身免疫性卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)模型小鼠的Bcl-2表达增加，FasL表达降低，细胞凋亡率明显下降，从而改善小鼠卵巢及免疫功能。

二至天癸方是连方教授依据滋补肾阴之旨自拟的经验方，由墨旱莲、女贞子、菟丝子、枸杞子、白芍、当归、熟地黄、川芎、制香附、炙甘草加减而成，为二至丸和四物汤的合方。周衡朴等[76]通过现代药理研究发现二至丸含有绿原酸、特女贞苷、橄榄苦苷等成分。绿原酸可抑制氧化应激条件下磷酸化信号转导子和转录激活子3的表达，促进Nrf2的表达，激活HO-1蛋白的表达，上调p-AKT蛋白的水平，起到抗氧化作用；橄榄苦苷抗氧化能力极强，可增加酶类抗氧化剂的水平，如SOD、GSH-Px、CAT，同时提高非酶抗氧化剂如GSH、β-胡萝卜素等水平，也可直接清除ROS；特女贞苷可降低Bax、胱天蛋白酶-3的表达，促进Bcl-2的表达，起到抗凋亡作用。刘其南等[77]研究表明，二至丸能够提高GSH-Px、SOD的活性，降低MDA的含量，减轻D-半乳糖诱导大鼠肾细胞的衰老程度。同时有研究发现，H2O2诱导的大鼠胰岛细胞瘤细胞(Islet Cell Tumor Cells,INS-1)ROS水平明显升高，二至丸能提高其抗氧化应激能力[78]。四物汤可以影响高龄雄鼠脾组织中花生四烯酸的表达，而花生四烯酸与氧化应激关系密切，对氧化应激有双向调节作用，既能诱导产生氧化应激，也能抑制氧化应激[79-80]。课题组前期研究显示，二至天癸方能改善高龄不孕症患者的肾阴虚状态，减少Gn用量，提高其正常受精率及可利用胚胎率[81]，可通过降低卵泡液内8-异前列腺素F2α(8-epi-prostaglandinF2α，8-isO-PGF2α)、晚期氧化蛋白产物(Advanced Oxidation Protein Products，AOPP)表达，增强抗氧化剂SOD的表达，调控高龄DOR患者的氧化应激反应，提高高龄患者卵细胞质量及胚胎发育潜能[15]；二至天癸方合并祛瘀解毒方可以抑制子宫内膜异位症不孕患者卵泡液中ROS、颗粒细胞胱天蛋白酶-3蛋白的表达，影响卵巢的藏泄功能[82]。同时连芳和相珊[83]研究发现，二至天癸方可明显改善不孕症IVF-ET患者的肾虚症状，通过调控PI3K/AKT信号转导通路，抑制颗粒细胞凋亡，改善卵母细胞质量，提高临床妊娠率。

3 小结

通过总结以上内容，我们得知女性的临床妊娠结局与年龄密切相关；高龄女性卵母细胞的氧化应激水平明显增高，凋亡因子表达升高，加速了卵母细胞的闭锁，导致高龄女性卵细胞质量下降，补肾中药在高龄不孕女性的治疗中表现出了多环节作用的特点，通过提高卵巢的抗氧化能力，改善卵巢储备功能，提高卵细胞质量，改善高龄不孕女性体外助孕结局。但是补肾中药减轻氧化应激损伤的具体作用机制目前尚不清楚，值得进一步探究。

4 讨论

近几年来，中药在减轻氧化应激损伤方面的研究日益增多，补肾阴中药、补肾阳中药和中药复方在抗氧化损伤中表现出了积极的作用。但是目前补肾中药在高龄不孕抗氧化治疗中的研究较少，在今后的研究中需要进行多中心、大样本、前瞻性研究以明确补肾中药在高龄不孕IVF-ET患者中的临床效果，并在此基础上进一步探讨其作用于卵巢的复杂机制，用大量的客观数据资料证实中医药在高龄不孕IVF-ET患者中的价值，充分发挥中医药的优势，探索中医药的抗氧化作用机制，以期为高龄不孕女性带来福音。