E2F1、survivin和mutp53在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

王锦航 彭士雄 赵建广 陈彦平 崔子峰

头颈癌在全球发病率中排第七位，其中口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）较为多见[1]。近年对于OSCC的治疗方案不断更新，如在常规治疗中联合免疫、靶向治疗等新模式，这使得部分患者的无瘤生存期延长，但总体患者的五年生存率却没有显着改变，仍保持在50~60%[2]，因此仍有必要阐明OSCC发生或进展的潜在分子机制。

E2F1是E2F转录因子家族成员，参与调控细胞周期、凋亡和DNA修复等过程，在乳腺癌、肺癌和胃癌等多数癌症中被证明高表达可以促进癌症的发生或进展[3]。survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族成员，在正常组织中低表达或不表达，但在多数癌症中却呈高表达，这一特性使其成为癌症治疗中潜在的理想靶标[4]。p53可通过诱导细胞凋亡或细胞周期停滞起到肿瘤抑制因子的作用，但在多数癌症中编码p53蛋白的TP53基因发生突变，产生突变型p53（mutant p53,mutp53），使原本的肿瘤抑制作用部分或完全丧失，从而促进恶性转化[5]。通过以上三者的特征推测，它们在OSCC中可能也发挥着重要的作用，因此本研究拟通过免疫组化检测E2F1、survivin和mutp53蛋白在OSCC中的表达情况，并探讨三者表达以及与患者临床病理特征间的相关性，为OSCC发生或进展机制的阐明提供新思路。

资料与方法

1.病例资料

收集于2013年1月至2014年12月间，52例经河北医科大学第四医院口腔颌面外科手术切除的OSCC患者肿瘤组织及相应癌旁组织（距肿瘤边缘＞2.0 cm）样本，详细临床病理资料见表1。所有患者术前均未接受任何肿瘤相关治疗，且术后组织样本由至少两名病理科医师独立进行诊断，证实肿瘤组织具有典型鳞癌形态（图1）以及癌旁为正常组织。该研究已通过河北医科大学第四医院伦理委员会审批（编号：2020KY283），患者均已签署知情同意书。

图1 OSCC组织（HE，A×200，B×400）

表1 52例OSCC患者的临床病理资料

2.免疫组化染色和结果判定

取OSCC和相应癌旁样本的石蜡包埋组织，制成4μm的组织切片。SP试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司，北京）行E2F1/survivin/mutp53蛋白的免疫组化染色。石蜡包埋的组织切片在二甲苯中脱蜡，100%~75%的梯度乙醇溶液中再水化，3% H2O215 min阻断内源性过氧化物酶活性，0.1M EDTA（pH8.0）/枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）100℃2 min行抗原修复，正常羊血清封闭15 min。接下来，将切片与1：25的E2F1抗体（ab4070；NeoMarkers，USA）/1：50的survivin抗体（BM3975；博士德公司，武汉）/1：50的mutp53抗体（sc47698；普利莱基因技术有限公司，北京）4℃过夜，PBS冲洗后加入二抗（中杉金桥生物技术有限公司，北京）37℃15 min。然后，将切片用DAB显色（中杉金桥生物技术有限公司，北京），使用苏木精染色溶液复染1 min，置于80%~100%梯度乙醇溶液中脱水后，中性树胶封片。最后，在显微镜下观察染色的组织切片并捕获图像进行分析。以PBS缓冲液替代一抗的阴性切片作为阴性对照，E2F1、mutp53蛋白阳性表达为细胞核内呈棕褐色的颗粒，survivin蛋白阳性表达为细胞质或细胞核中呈棕黄色的颗粒。

判定标准为5个高倍镜视野中计算100个肿瘤细胞中蛋白表达的阳性细胞百分比，＜5% 0分，5%～＜25% 1分，25%～＜50% 2分，51%～75% 3分，＞75% 4分；染色水平，无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两项评分相加为每例标本蛋白表达的积分：0～1分 阴性（-），2～3分 弱阳性（+），4～5分 中度阳性（++），6～7分 强阳性（+++）。免疫组化结果至少由2名病理科医师在双盲情况下观察所得。

3.统计学处理

应用SPSS（v17.0）软件行统计学处理，计数资料由n表示。表达差异应用χ2检验分析，表达间的相关性应用Spearman等级相关性分析，与临床病例特征的相关性应用非参数Mann-Whitney U检验（两组间）和非参数Kruskal-Wallis检验（多组间）分析。结果均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.E2F1、survivin和mutp53蛋白在OSCC和癌旁组织中的表达差异分析

E2F1（图2）、mutp53（图3）的阳性产物呈深褐色颗粒位于细胞核，survivin（图4）的阳性产物呈棕黄色的颗粒多数位于细胞核。分析结果由表2所示，E2F1、survivin和mutp53蛋白在OSCC组织中的阳性表达率分别为75.00%（39/52）、88.50%（46/52）和82.70%（43/52），均高于相应癌旁组织（P＜0.001）。

表2 免疫组化检测E2F1、survivin和mutp53蛋白的表达

图2 E2F1在OSCC和癌旁组织中的表达

图3 mutp53在OSCC和癌旁组织中的表达

图4 survivin在OSCC和癌旁组织中的表达

2.OSCC组织中E2F1与survivin、mutp53蛋白表达间的相关性分析

对OSCC组织中E2F1、survivin和mutp53蛋白免疫组化结果行Spearman等级相关性分析。结果由表3所示，OSCC组织中E2F1蛋白的表达与survivin（rs＝0.446，P＝0.001）和mutp53（rs＝0.386，P＝0.005）蛋白的表达均呈正相关。

表3 OSCC中E2F1与survivin、mutp53蛋白表达间的相关性

3.OSCC组织中E2F1、survivin和mutp53蛋白表达水平与患者临床病理特征间的相关性分析

分析结果由表4所示，E2F1蛋白的表达水平与OSCC患者的性别（P＝0.5864）、年龄（P＝0.352）、细胞分化（P＝0.089）、淋巴结转移（P＝0.097）和肿瘤分期（P＝0.247）均无相关性。survivin蛋白表达水平与OSCC患者的细胞分化（P＝0.005）、淋巴结转移（P＜0.001）及肿瘤分期（P＜0.001）相关，但与年龄（P＝0.385）和性别（P＝0.693）无关。mutp53蛋白表达水平与OSCC患者的细胞分化（P＝0.001）、淋巴结转移（P＜0.001）及肿瘤分期（P＜0.001）相关，但与年龄（P＝0.875）和性别（P＝0.838）无关。

讨 论

E2F1作为调控数千个下游靶基因的转录因子在细胞核中起着重要作用，其异常表达可影响肿瘤细胞的代谢重编程或肿瘤进展[6]。Jiang等[7]研究表明，E2F1可通过影响葡萄糖摄取、乳酸或ATP产生来调节尤因肉瘤细胞中的有氧糖酵解途径以促进病情发展，可作为潜在的治疗靶点。Chen等[8]的研究中，E2F1在肾透明细胞癌中呈高表达，并且其高表达与患者的总生存期和无进展期较短有显著相关性，表明E2F1可能起到促癌作用。但另有研究却发现相反的结论，如在前列腺癌中E2F1充当肿瘤抑制因子的角色[9]，这可能取决于不同病理组织的特异性。尽管在多种癌症中E2F1的功能已经得到明确，但尚未证实其在OSCC发生或恶性进展中是否发挥作用。本研究通过免疫组化分析发现E2F1蛋白在OSCC中呈高表达，可能发挥促癌基因的作用。但在进一步分析与OSCC患者临床病理的关系时发现，E2F1的高表达与性别、年龄、细胞分化、淋巴结转移和肿瘤分期均无相关性。这与Shen等[10]研究结论相似，E2F1在胃癌组织中的表达高于低级别上皮内瘤变组织，但与胃癌患者的淋巴结转移、临床分期、浸润深度和远处转移等因素均无相关性，提示E2F1的突变过表达可能发生在癌变早期，待完全转变为恶性后其表达则无明显变化。因此，本研究推测OSCC中E2F1蛋白的高表达可能也是癌变早期的关键步骤，值得进一步探讨证实。

为挖掘可能与E2F1发挥协同作用的异常活化蛋白，研究选择了具有E2F结合位点的survivin蛋白进行分析[11]。作为IAP家族中最小的成员，survivin在胚胎发育过程中起着重要作用，但在多数终末分化的组织中表达却是沉默的，这使得成年人中survivin的表达被视为癌症的首要指标[12]。而survivin同时也是p53的直接靶标，这也从p53的抑制作用解释了成年人体内缺乏survivin的原因[13]。作为一种强大的癌症抑制因子，p53可通过促进细胞生长停滞、DNA修复以及调节自噬或代谢等方式来保护基因组[14]，然而编码p53肿瘤抑制蛋白的TP53基因约在50%的人类癌症中高度突变，导致完整p53蛋白中的单个氨基酸被取代而产生mutp53，使原本具有的肿瘤抑制作用部分或完全丧失，并获得独立于野生型p53的新致癌活性[15，16]。本研究先行通过免疫组化检测了survivin和mutp53蛋白的表达，发现两者均在OSCC中呈高表达，并且都与患者的细胞分化、淋巴结转移及肿瘤分期相关，其中强阳性例数随细胞分化越低、伴有淋巴结转移或TNM分期越高等因素而增多。进一步经Spearman等级相关性分析发现，E2F1蛋白的表达水平与survivin和mutp53蛋白的表达水平均呈正相关。这些实验验证了本研究之前假设，survivin和mutp53的异常高表达状态可能在OSCC的发生或进展中与E2F1发挥着协同作用。