敲低FAM83B对舌鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

黑乃恒 刘 鹏 陈彦平 靳琳玉 包 阳

舌鳞状细胞癌在口腔癌中发病率最高，舌鳞状细胞癌的发病率呈逐步上升的趋势[1，2]，患病年龄也呈现出年轻化的势头[3，4]。舌鳞状细胞癌患者5年生存率不足50%，恶性程度高，预后差。它的病因不明，危险因素主要包括遗传因素、环境因素、局部不良刺激等。最新研究表明，这些危险因素继续影响口腔组织细胞的生理环境，不同程度地导致分子表达异常或紊乱，促进肿瘤的发生发展，包括FAM83B的表达。FAM83B已被证实为EGFR/RAS信号通路的重要中介物并在多种癌症中在mRNA水平高表达，包括乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、睾丸甲状腺癌和卵巢癌[5]。目前尚未对鳞状细胞癌患者中其蛋白表达及其与临床病理因素的关系进行详细的研究，对FAM83B在舌鳞状细胞癌中的表达及相关研究更是鲜有报道。本研究运用MTT实验、划痕愈合实验、Ttanswell实验和流式细胞技术分别评价敲低FAM83B舌鳞癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力及凋亡的变化，初步探讨FAM83B在舌鳞癌发生、发展中的作用。

资料和方法

1.材料

（1）细胞株：SCC-9、Cal-27人舌鳞状细胞癌细胞株购于中国医学科学院基础医学细胞中心。

（2）主要试剂及器械：Transwell小室(Corning)，TRIpure（BioTeke），FAM83B antibody（GeneTex），凝胶成像系统（北京六一，北京），荧光定量PCR仪（BIONEER，韩国）。

2.方法

（1）细胞培养：人舌鳞癌细胞系SCC-9和Cal-27培养于含有10% FBS的DMEM-F12培养基中，培养箱的条件设置为37℃，5% CO2将细胞置于其中培养。选择对数生长期细胞进行转染。

（2）小干扰RNA引物设计、分组及转染：根据FAM83B的基因序列，通过特异性siRNA引物设计网站设计并筛选出了一条靶向FAM83B基因的siRNA（FAM83B siRNA，上游序列5＇-GCAACAAC GAATGCCAACC-3＇，下游序列5＇-ACGAAGCCGA GAATGAGTA-3＇），课题前期这部分工作先行已经完成。同时设计不针对任何基因的随机序列CsiRNA-NC 5＇-GGCACCCAGCACAATGAA-3＇，5＇-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3＇，以上序列均由上海生工生物工程有限公司合成。根据实验设计，设置A、B、C、D、E共5组，A未转染组（Control）B阴性对照转染组（NC）C siRNA-1转染组（siRNA-1）D siRNA-2转染组（siRNA-2）E siRNA-3转染组（siRNA-3），先行利用阳离子脂质体Lipofectamine2000转染，48 h后，各组中FAM83B的干扰效率通过Western blot的检测来完成。根据上述结果，选择干扰效果最好的一组进行实验。

（3）选择干扰效果最好的1组作为实验组、空载体转染组作为阴性对照组、未转染组为空白对照组，分别检测各组的细胞增殖、迁移、侵袭能力及凋亡情况。

①MTT法检测各组细胞增殖能力：将每组细胞接种于96孔板中，每组设置5个复孔，5×103个为设置的每孔细胞个数，待细胞贴壁后进行细胞转染。将96孔板置于37℃、5% CO2的条件下培养0、24 h、48 h、72 h、96 h后进行MTT检测，每孔加入20μL MTT染色液，在细胞培养箱内继续孵育4 h，加入150μL DMSO以溶解细胞形成的紫色结晶，10 min的避光条件下静置后在酶标仪上测定其在570 nm处OD值，测定数据后进行分析。

②通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力：将各组细胞利用200μL pipette tip造成细胞划痕，通过清洗将细胞碎片清除，用显微镜按组观察并拍照。准备好37℃、5% CO2的培养箱并将各组细胞置于其中培养并拍照记录，记录的时间点为0 h、24 h、48 h。

③细胞侵袭能力通过Transwell：实验来测定每个样本取5个在倒置显微镜下的视野，对侵袭至微孔膜下层的细胞计数，取均数。

④流式细胞术：收集各组转染后细胞，离心、混匀、AV/PI双染孵育后流式细胞仪检测结果。

（4）统计学方法：应用SPSS 18.0统计软件分析数据。计量资料比较采用方差分析，多个样本均数间的比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Western Blot检测各组细胞中FAM83B蛋白表达结果

如图1、图2所示，A：未转染组（Control）；B：阴性对照转染组（NC）；C：siRNA-1转染组（siRNA-1）；D：siRNA-2转染组（siRNA-2）；E：siRNA-3转染组（siRNA-3）与其他组相比，SCC-9和CAL-27两细胞系中均是D组干扰RNA显著降低了FAM83B蛋白水平。因此，笔者选择D组干扰质粒进行后续分析。将运用D组质粒干扰后的SCC-9和CAL-27细胞定为实验组C和C＇，与空白对照组（A组、A＇组）及阴性对照组（B组、B＇组）比较，实验组SCC-9和CAL-27细胞中FAM83B表达量均明显降低（均P＜0.05），即转染成功，见图3。

图1 SCC-9细胞系中D组干扰RNA降低FAM83B蛋白水平最显著

图2 CAL-27细胞系中D组干扰RNA降低FAM83B蛋白水平最显著

图3 SCC-9和CAL-27两细胞系RNA干扰后实验组（C、C＇）FAM83B表达量均明显降低

2.MTT法检测增殖：实验组下调FAM83B表达后与空白对照组及阴性对照组比较，实验组SCC-9和CAL-27细胞OD值明显低于对照组（均P＜0.05），见图4、5。这表明下调FAM83B表达后，SCC-9和CAL-27细胞的体外增殖能力受到明显抑制。

图4 SCC-9细胞实验组体外增殖能力明显抑制，与空白对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义*P＜0.05。

图5 CAL-27细胞实验组体外增殖能力明显抑制，与空白对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义*P＜0.05。

3.迁移能力变化：结果显示FAM83B的敲低表达不但将愈合时间延长，对SSC-9、CAL-27的愈合能力也产生了较大影响，大大降低了愈合能力，与空白对照组及阴性对照组相比，细胞迁移能力显著降低（均P＜0.05），见图6、7。

图6 通过划痕实验，实验组SSC-9的愈合能力降低，与空白对照组和阴性相比差异有统计学意义*P＜0.05。

图7 通过划痕实验，实验组CAL-27的愈合能力降低，与空白对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义*P＜0.05。

4.侵袭能力变化：使用Transwell检测细胞的侵袭性，结果显示，与空白或阴性对照细胞相比，FAM83B敲低显著降低了细胞的侵袭性（均P＜0.05）见图8。

图8 Transwell检测，SSC-9、CAL-27实验组侵袭能力降低与对空白对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义*P＜0.05。

5.凋亡情况：流式细胞术AV/PI双染显示实验组的凋亡率显著高于对照组，转染的SCC-9和CAL-27细胞凋亡率明显升高（均P＜0.05），见图9。表明FAM83B能抑制SCC-9和CAL-27细胞凋亡。

图9 AV/PI双染孵育后流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况：SSC-9、CAL-27实验组凋亡明显高于对照组，差异有统计学意义*P＜0.05。

讨 论

舌鳞状细胞癌的发病率高，早期即可发生颈淋巴结转移预后差[6]。寻找舌鳞状细胞癌有效的治疗靶点是学者研究的热点问题。最新研究显示具有序列相似性83的家族（FAM83）成员在多种癌症类型中具有致癌作用[7]，例如FAM83在多种人类腺癌中过表达，并促进肿瘤的增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为[8]；最新研究显示FAM83B可促进胃癌细胞的增殖[9]；FAM83B具有致癌作用可能与其含有DUF1669结构有关[10]。FAM83B蛋白中的DUF1669结构可以与CRAF结合，促进CRAF的膜定位从而增强MAPK信号。FAM83B蛋白还可与PI3K的亚单位和AKT结合，促进p110α和AKT的膜定位，从而增强AKT/m TOR信号[11]，因此针对MAPK和Akt/mTOR信号通路的靶向治疗时，FAM83B的表达水平可作为一个很重要的参考因素[12]。并有可能成为的新靶点[13]。传统的靶向药只是针对某一种信号通路，但是各个信号通路之间其实都是相通的，彼此形成了一张关系网，阻断其中一条会导致另外一条信号通路激活[14]。若只针对某一信号通路进行治疗，必然导致耐药。FAM83B可以同时作用于AKT/mTOR和MAPK信号系统，若抑制FAM83B的表达，从理论上来讲可以同时抑制AKT/m TOR和MAPK这两条信号系统。目前针对MAPK和Akt/m TOR信号通路的靶向治疗目前已应用于多种肿瘤的临床试验。FAM83家族成员对舌鳞癌细胞细胞功能的作用机制研究鲜有报道，近期有学者做了关于FAM83家族成员和头颈部肿瘤关系的研究，Ji[15]等研究发现，FAM83A的表达与头颈部鳞状细胞癌的肿瘤大小、淋巴结转移和临床肿瘤分期呈正相关；郭靖等研究发现[16]，涎腺导管癌的发生可能与FAM83H的过表达存在关联。笔者的研究结果初步表明，敲低FAM83B的表达可以对舌鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移起到抑制作用，对细胞凋亡起到促进作用，但这一作用的具体调控途径有待进一步研究。FAM83B有可能成为舌鳞状细胞癌靶向治疗新的靶点，为舌鳞状细胞癌的治疗提供新的思路。