超声-低共熔溶剂提取玉米芯黄酮的纯化与活性测定

黎 莉，杨景淇，于德涵，曲 男，徐 喆，孙 悦

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061）

2020年，中国玉米产量为2.601亿t，仅次于美国居于世界第二位，伴随着玉米生产，每年加工玉米产生的附属物——玉米芯有近7 000万t。玉米芯中除含有大量纤维素多糖外，还含有诸如黄酮、酚类、蛋白质、氨基酸等多种活性成分。中国对玉米芯的综合利用率不足20%，除少量用于饲料加工、食品轻工原料和造纸外，绝大多数都被焚烧或丢弃，造成资源浪费的同时还给环境带来很大的压力［1］。

低共熔溶剂（Deep eutectic solvents，DES）是由Abbott等［2］于2003年提出的一种类似于离子液体的新型溶剂，其配制简便、易于保存、安全无毒、成本低，是一种可生物降解的环境友好型溶剂。目前，DES在生物活性成分的提取方面应用较多，更因其多种优点而渐渐有取代传统提取试剂的趋势，表现出了巨大的潜力。在前期试验中，考察并优化了DES提取玉米芯黄酮的条件，使用DES对玉米芯黄酮进行提取，提取率较传统有机试剂提取提高了45%，后续对玉米芯黄酮的纯化工艺继续进行探究，优化玉米芯黄酮的吸附纯化工艺，考察纯化黄酮的抗氧化性、抑菌性和降糖性，以期为玉米芯的综合应用提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米芯，采集于黑龙江省绥化市北林区，品种为先玉335；试验用菌种由绥化学院微生物实验室保藏；大孔吸附树脂购自东鸿化工有限公司；芦丁标准品、阿卡波糖（纯度＞95%），购自北京索莱宝科技有限公司；其余试剂皆为国产分析纯，购自南京都莱生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

752型号分光光度计（上海菁华仪器有限公司）；YXQ-LS-75SⅡ型蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；JY92-IIDN型超声波仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ZD-85型恒温振荡器（江苏荣华仪器制造有限公司）；HL-2型蠕动泵、玻璃层析柱（16 mm×240 mm）（上海青浦沪西仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 超声辅助低共熔溶剂提取玉米芯黄酮和含量测定DES制备：将氯化胆碱和乙二醇以1∶3的比例进行混合，按混合溶液体积30%的比例加入去离子水，在65～80℃的水浴中加热搅拌，至溶液澄明为止，溶液取出冷却至室温，备用。

玉米芯黄酮的提取∶玉米芯烘干至恒重，粉碎后过筛，向玉米芯粉末内按20∶1（mL∶g）液料比加入DES，充分混匀后于60℃、功率135 W条件下超声提取20 min。提取液冷却后以4 500 r∕min离心10 min，取上清液于旋转蒸发仪中浓缩蒸发至无液体蒸出，蒸发后余液保存于棕色瓶中，测定黄酮溶液浓度，备用。黄酮含量的测定方法和具体操作参考文献［3］。

1.3.2 树脂活化将树脂置于烧杯中，使用无水乙醇浸泡24 h至充分溶胀，去除漂浮物后湿法装柱，树脂柱高16 cm；树脂经去离子水充分洗涤后浸4%HCl 4 h，用去离子水洗至中性再浸4% NaOH 4 h，去离子水洗至中性，备用［4，5］。

1.3.3 大孔吸附树脂的筛选利用静态吸附和静态洗脱筛选适宜纯化玉米芯黄酮的树脂，待选大孔吸附树脂型号及参数见表1。

表1 大孔树脂参数

分别称取表1中各树脂3.0 g（湿重），置于容量为100 mL的碘量瓶中，每瓶加入15 mL提取液，封口后在恒温振荡器上以50 r∕min旋转振摇吸附24 h。抽滤，测滤液中黄酮含量，计算吸附率。滤下的树脂用去离子水洗涤至溶液无色，于100 mL碘量瓶中加入30 mL 70%乙醇溶液，封口后继续振摇24 h，抽滤，测定滤液中黄酮含量，计算解吸率［6，7］。每种树脂做3个平行试验，取平均值进行计算，根据各树脂的吸附率和解吸率，比较、筛选最适树脂。

式中，C1、C2和C3分别是上样液浓度、流出液浓度、洗脱液浓度（mg∕mL）；V1、V2和V3分别是上样液体积、流出液体积和洗脱体积（mL）。

1.3.4 玉米芯黄酮纯化工艺优化使用“1.3.3”的方法筛选出树脂，以吸附率为评价指标，分别改变上样浓度、上样pH和上样速率，考察各因素单独变化对黄酮吸附效果的影响；树脂吸附饱和后，再分别改变洗脱过程中洗脱液量、洗脱液浓度和洗脱液流速，以解吸率为评价指标考察上述因素变化其对吸附纯化解吸效果的影响［8］。上样流出液中黄酮残余量达到上样液黄酮含量的10%时认定为树脂吸附达到饱和。每组做3次平行试验。

1）上样液浓度对吸附率的影响。选择pH 5.0、流速30 mL∕h，上样液浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg∕mL进行吸附，测定其吸附率。

2）上样液pH对吸附率的影响。黄酮类化合物结构中多含有酚羟基，会增加该类物质在碱性溶液中的溶解性，不利于吸附，故调节上样液显酸性。设置上样液pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，上样浓度和流速分别为1.0 mg∕mL和30 mL∕h，测定其吸附率。

3）上样流度对吸附率和效率的影响。上样流速慢时吸附较为充分，但操作时间长；上样流速快能有效缩短纯化时间、提高效率，但容易造成吸附率下降。设置上样液流速分别为15、30、45、60、75 mL∕h，pH 4.0、浓度1.0 mg∕mL，考察吸附效果最理想的上样流速。

4）洗脱液浓度对解吸率的影响。XAD-2树脂以优化后的吸附条件吸附玉米芯黄酮至饱和，分别选择体积分数为40%～90%（梯度10%）的乙醇溶液60 mL作洗脱液，流速90 mL∕h，计算解吸率。

5）洗脱液流速对解吸率的影响。使用70%乙醇60 mL作洗脱液，设置洗脱流速分别为60、90、120、150、180 mL∕h，计算解吸率。

6）洗脱液体积对解吸率的影响。洗脱液用量少时，可能洗脱不完全，导致一部分吸附物残留在树脂上；洗脱液用量过多时，又会导致洗脱后半程洗脱液中无产物，浪费时间。使用总量为90 mL的洗脱液进行过柱洗脱，柱下每收集10 mL洗脱液后更换容器，共收集9瓶10 mL的洗脱液，1～9号瓶对应洗脱液为10～90 mL，计算每瓶洗脱液的解吸率。

1.3.5 纯化效果验证最佳纯化条件下，对玉米芯黄酮溶液进行纯化，对比纯化前、后溶液纯度，通过检测2种溶液浓度的变化计算纯化倍数，验证试验操作3次，最终结果取平均值。

1.3.6 体外活性检测

1）抗氧化能力测定。考察质量浓度相同的纯化和未纯化玉米芯黄酮对DPPH·和ABTS·的清除能力的差异。

黄酮对DPPH·的清除能力测定：在具塞试管中加入浓度为0.1 mmol∕L的DPPH·乙醇溶液3.5 mL和无水乙醇0.5 mL，混匀后暗处静置30 min，于517 nm处测定吸光度（A1）；替换上管中无水乙醇为相同体积的纯化液∕粗提液，重复其他操作，吸光度记为（A2）；对照管中仅添加3.5 mL乙醇和0.5 mL纯化液∕粗提液，其他操作同上，吸光度记为（A3）。对照组以维生素C溶液替换黄酮溶液［9］。

黄酮对ABTS·的清除能力测定：精密称量ABTS 38.4 mg溶于10 mL去离子水中，再称量过硫酸钾13.5 mg溶于10 mL去离子水中，将二者转移至25 mL容量瓶中用去离子水定容至刻度，遮光静置12 h后制得ABTS母液，将ABTS母液稀释16倍得到工作液，工作液现用现配。具塞试管中加入ABTS工作液2 mL、无水乙醇1.5 mL、纯化液∕粗提液0.5 mL，混匀后常温静置6 min，测定734 nm下的吸光度（A1）；替换上管中ABTS工作液为等体积的无水乙醇，其他操作不变，吸光度记为（A2）；对照管中加入无水乙醇和ABTS工作液各2 mL，其他操作同上，吸光度记为（A3）［10］。对照组以维生素C溶液替换黄酮溶液。ABTS·清除率公式为：

2）抑菌活性测定。选择金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌进行抑菌圈试验［11］，测定玉米芯黄酮的抗菌活性。

3）降糖活性测定。将0.5 mL不同浓度的纯化液∕粗提液加入25 mL血糖管中，加入0.5 mL α-淀粉酶溶液后在37℃水浴中保温2 min，再加入37℃温育的0.1%淀粉溶液2 mL，充分混匀后37℃反应3 min后，加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂混匀，沸水浴8 min，显色稳定后取出流水冷却至室温，加去离子水至刻度，盖紧管塞颠倒混匀后于540 nm光波下测吸光度（A1）；空白对照组用等体积的磷酸缓冲液替代黄酮溶液，吸光度记为（A2），以阿卡波糖作阳性对照［12］，计算抑制率。

所有体外活性检测试验均设3组平行。

2 结果与分析

2.1 线性回归方程

绘制标准曲线测定黄酮含量，曲线回归方程为y=0.093 1x+0.002 3，R2=0.999 3。

2.2 大孔吸附树脂的筛选

大孔吸附树脂筛选的结果见图1。在考察的8种树脂中，3种无极性树脂和2种弱极性树脂的吸附率值相对较高，其中弱极性吸附树脂的吸附率稍大，但解吸率较低，表明这2种树脂吸附后再生较其他树脂困难；无极性树脂的吸附率都比较接近，其中HPD-100树脂解吸率稍低，D101树脂的吸附率在这3种树脂中最低，所以从效率和纯化效果等因素考虑，选择综合效果最好的XAD-2树脂作为玉米芯黄酮的纯化树脂。

图1 不同大孔吸附树脂对玉米芯黄酮的静态吸附/解吸特性

2.3 玉米芯黄酮纯化工艺优化

2.3.1 上样液浓度对吸附率的影响由图2可知，上样液浓度低时，即上样浓度不高于1.0 mg∕mL时，吸附率维持在较高水平，随着上样浓度的加大，吸附率有少量的增加；再继续加大上样液的浓度，吸附率下降。这是因为上样浓度较低时，树脂吸附能力不能完全发挥，此时吸附率虽然较高，但是达到吸附饱和所用的时间更长，效率较低；而上样浓度过高时，溶液中的杂质会和黄酮发生吸附竞争，阻碍黄酮被吸附，导致吸附率降低，所以选择1.00 mg∕mL作为最佳吸附浓度。

图2 不同上样液浓度对树脂吸附率的影响

2.3.2 上样液pH对吸附率的影响由图3可见，pH 4.0时吸附率最高，为75.1%，偏离此pH吸附率都会下降。pH高于4.0时，吸附率下降可能是因为弱酸近中性环境有利于黄酮中酚羟基的解离，加强了黄酮和溶剂间的相互作用，抑制吸附；而pH过低时吸附率下降，则可能是因为黄酮结构中含有酮式羰基，在强酸环境下成烊盐，且以离子状态存在，从而降低吸附率。故选择4.0为最优pH。

图3 不同上样液pH对树脂吸附率的影响

2.3.3 上样流速对吸附率的影响由图4可见，上样液流速慢，上样液和树脂接触时间长、黄酮有充分的时间扩散到树脂内部，吸附率较高；而随着上样液流速的加快，黄酮在层析柱中停留时间短，吸附率随之降低，所以上样流速选择15 mL∕h最佳。

图4 不同上样流速对树脂吸附率影响

2.3.4 洗脱液浓度对解吸率的影响由图5可知，乙醇体积分数为70%时解吸率最高，偏离这个浓度解吸率都会下降，而且偏离的越远，解吸率越低。原因可能是玉米芯黄酮的极性和70%乙醇溶液的极性最为接近，根据“相似物溶解相似物”原则，玉米芯黄酮在该浓度的乙醇溶液中溶解度最大，从而最易洗脱，解吸率大，故70%乙醇溶液洗脱效果最佳。

图5 不同洗脱液浓度对树脂解吸率的影响

2.3.5 洗脱液流速对解吸率的影响由图6可知，洗脱液流速越慢，解吸率越高，因为洗脱液流速慢，能和吸附物充分接触和溶解，洗脱充分；洗脱液流速加快后，洗脱不完全，树脂中吸附残留成分多，导致解吸率降低。所以，洗脱的最佳流速选择60 mL∕h。

图6 不同洗脱液流速对树脂解吸率的影响

2.3.6 洗脱液体积对解吸率的影响由图7可知，随着洗脱操作的进行，编号靠后的洗脱液收集瓶中的黄酮含量越来越少，解吸率越来越低，7～9号收集瓶中几乎测量不到黄酮，故选择洗脱液体积为70 mL。

图7 不同洗脱液用量对树脂解吸率的影响

2.4 玉米芯黄酮纯化结果验证

将pH 4.0、浓度1.00 mg∕L的上样液以15 mL∕h的速度流经XAD-2大孔树脂，待吸附饱和后用体积分数为70%的乙醇70 mL、以60 mL∕h的速度进行洗脱。经计算，玉米芯黄酮纯化液纯度为粗提液纯度的2.65倍，说明上述条件下，XAD-2大孔树脂纯化玉米芯黄酮工艺效果良好。

2.5 体外活性检测结果

2.5.1 黄酮的抗氧化性纯化液和粗提液对HPPH·和ABTS·的清除能力结果见图8。由图8可知，在测试浓度范围内，随着浓度的升高，黄酮和维生素C对DHHP·的清除能力增强，同等浓度条件下，玉米芯黄酮的DPPH·清除能力不及维生素C。纯化黄酮抗氧化能力明显强于未纯化黄酮，即纯化能提高其抗氧化性。

图8 玉米芯黄酮对DPPH·和ABTS·的清除能力

黄酮和维生素C对ABTS·的清除能力也随着浓度的升高而增强，维生素C的ABTS·清除能力明显强于黄酮；纯化操作能增强黄酮对ABTS·的清除能力。

2.5.2 黄酮的抗菌能力黄酮具有广谱抗菌作用，其对于参与试验的3种细菌的抑菌能力结果见表2。由表1、2可知，玉米芯黄酮对3种细菌的抑制作用随着黄酮浓度的增高而加强，其中，对枯草芽孢杆菌作用最弱，而对金黄葡萄球菌的作用最强。纯化后的黄酮溶液抑菌能力有所增强。

表2 不同黄酮浓度对抑菌圈直径的影响 （单位：mm）

2.5.3 黄酮的降糖活性测定不同浓度黄酮对α-淀粉酶的抑制能力如图9所示。由图9可知，纯化物和阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制作用明显高于粗提物，并且随着浓度的增加而加强。玉米芯黄酮纯化物和阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制作用接近，说明纯化玉米芯黄酮和阿卡波糖的降糖能力相当。

图9 不同浓度玉米芯黄酮对α-淀粉酶的抑制作用

3 小结

本研究主要探讨了纯化玉米芯黄酮的体外活性，并对玉米芯黄酮的XAD-2大孔树脂纯化工艺进行了优化，得出结论如下：8种待选树脂中，XAD-2树脂对玉米芯黄酮的吸附和解吸综合效果最佳，可以作为其纯化的吸附介质；最优吸附条件为上样浓度1.00 mg∕mL、上样液pH 4.0、上样流速15 mL∕h，最佳洗脱条件是70 mL体积分数为70%的乙醇，洗脱速度60 mL∕h，可将玉米芯黄酮纯化2.65倍；玉米芯黄酮具有弱于维生素C的抗氧化性，对DPPH·和ABTS·的清除能力随着玉米芯黄酮浓度的增加而增强，纯化后抗氧化能力增强；玉米芯黄酮的抑菌效果随浓度增加而增强，纯化后的抑菌能力更强，3种试验细菌受抑制程度为金黄葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌；体外降糖试验表明，玉米芯黄酮对α-淀粉酶的抑制作用随浓度加大而增强，纯化黄酮和阿卡波糖有相近的降糖效果。

由以上研究结论可知，采用低共熔溶剂提取玉米芯总黄酮后利用XAD-2大孔树脂纯化，此工艺流程可行。