一测多评法测和兴白花油中5种成分含量的研究*

陈高翩 黄俊忠 徐万帮 方 竑

[广东省药品检验所中成药室/中药材(饮片)室，广东 广州 510700]

中成药成分复杂，单一成分难以体现中药的优势，但是多成分的质量分析要求的对照品也相应增加，大部分对照品提取繁琐且成本高，不利于质量控制，故提出了一测多评(QAMS)法多成分质量控制的思路[1]。该方法相比之前多成分的质量分析，大大缩小了提取时间和降低了检验成本。因此，一测多评法相继应用于各个中药的质量控制[2-5]。

目前，白花油的质量评价以薄荷脑、樟脑与水杨酸甲酯为主[6-8]，且这3种成分均为挥发性物质，沸点较低，有关这些成分的测定多采用常规外标法单独检测组分的含量。本实验将“一测多评”的方法首次应用到和兴白花油的质量控制中，在不使用任何内标物前提下，同步测定薄荷脑、樟脑、水杨酸甲酯、桉油精、芳樟醇5种有效活性成分。

1 仪器与试药

1.1 仪器 气相色谱仪(型号：GC-2010 PLUS，日本岛津公司)；氢气发生器(型号：HG-1803A，北京科普生分析科技有限公司)；空气发生器(型号：AG-1602，北京科普生分析科技有限公司)；色谱柱：HP-INNOWAX毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷伦科技有限公司)，InertCap WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本GL Science)；电子分析天平(型号：CP225D，SARTORIUS公司，精度：万分之一)。

1.2 试药 和兴白花油(生产批号：PGEBH062、PGEBH046、PGEBH015、PGEBH011、PGEBH031、PGEBH001、PDKBG023、PDKBG025、PDKBG033、PGEBG066、PGEBG083、PGEBG095、PGEBG081、PGEBG093、PGEBG101、PGEBG080、PGEBG122、PGEBG132，规格：每瓶装20 mL、每瓶装10 mL、每瓶装5 mL、每瓶装2.5 mL，香港和兴白花油药厂有限公司提供)；桉油精对照品(批号：110788-201105，含量99.9%，购自中国食品药品检定研究院)；樟脑对照品(批号：110747-201409，含量98.7%，购自中国食品药品检定研究院)；芳樟醇对照品(批号：111503-201302，含量98.5%，购自中国食品药品检定研究院)；乙酸芳樟醇对照品(批号：A14420，含量96.9%，香港和兴白花油药厂有限公司提供)；薄荷脑对照品(批号：110728-200506，含量100.0%，购自中国食品药品检定研究院)；水杨酸甲酯对照品(批号：110707-201413，含量99.7%，购自中国食品药品检定研究院)；无水乙醇为分析纯(批号：20171001-2，含量99.7%，购自广州化学试剂厂)；乙酸乙酯为分析纯(批号：20171203-2，含量99.5%，购自广州化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 一测多评方法学考察

2.1.1 色谱条件 色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；柱温为程序升温，起始温度为80 ℃，以10 ℃/min升温至180 ℃，保持3 min；检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，温度为220 ℃，进样口温度为200 ℃，载气为氮气，进样量为1 μL；分流比60∶1；理论板数按薄荷脑峰计算应不低于60 000，2个相邻色谱峰的分离度R>1.5。对照品及样品GC图谱见图1。

注：A为混合对照品，B为样品；1.桉油精；2.樟脑；3.芳樟醇；4.薄荷脑；5.水杨酸甲酯图1 对照品及样品GC图谱

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 混合对照品储备液的制备 精密称取薄荷脑对照品3.032 4 g、樟脑对照品0.618 6 g、水杨酸甲酯对照品4.002 3 g、桉油精对照品1.801 9 g、芳樟醇对照品0.301 2 g，同置于100 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，制得混合对照品储备液。

2.1.2.2 供试品的制备 精密量取和兴白花油1 mL，置50 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀即得。

2.1.2.3 阴性对照溶液的制备 按照和兴白花油的处方比例和制备方法，分别制备缺少桉油精、樟脑、芳樟醇、薄荷脑以及水杨酸甲酯的阴性对照样品，再按“2.1.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.3 线性范围考察 分别精密吸取“2.1.2.1”项下的薄荷脑、樟脑、水杨酸甲酯、桉油精及芳樟醇混合对照品储备液0.25、0.5、1、2、3、5、6 mL置于7个不同的10 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，制成一系列浓度的薄荷脑、樟脑、水杨酸甲酯、桉油精、芳樟醇混合标准溶液。精密吸取1 μL上述混合对照品溶液，分别进样分析测定各成分的峰面积，以浓度对峰面积积分值进行回归处理，得各成分的回归方程和线性范围。结果见表1。

表1 5种成分回归方程和线性范围

2.1.4 待测成分相对校正因子计算 依“2.1.3”项下各梯度浓度的对照品母液求得的结果(见表1～表4)，以薄荷脑作为内参物，计算薄荷脑对樟脑、桉油精、水杨酸甲酯、芳樟醇的相对校正因子，结果见表2。

表2 4个待测成分与薄荷脑的相对校正因子

2.1.5 精密度试验 精密量取“3.1.2.1”项下混合对照品5 mL，加无水乙醇定容置25 mL容量瓶，摇匀即得。精密吸取1 μL注入气相色谱仪，记录各待测成分(桉油精、樟脑、芳樟醇、薄荷脑、水杨酸甲酯)的峰面积，重复测定6次，进行日内精密度试验；每天2次，进行日间精密度试验。日内精密度试验结果，上述各待测成分的峰面积的RSD分别为0.35%、0.41%、0.38%、0.45%、0.41%；日间精密度试验结果，上述各待测成分的峰面积的RSD分别为0.53%、0.46%、0.57%、0.51%、0.62%。结果表明仪器精密度良好，符合定量分析的要求。

2.1.6 重复性试验 精密移取供试品(批号：PGEBH062)6份，按“2.1.2.2”项下供试品制备，分别精密吸取1 μL进样测定，计算桉油精、樟脑、芳樟醇、薄荷脑、水杨酸甲酯5种成分的平均含量及其RSD。结果平均含量分别为156.82、287.49、57.38、390.27和22.99 mg·mL-1，RSD分别为0.17%、0.16%、0.19%、0.21%、0.22%，表明该方法重复性较好。

2.1.7 稳定性试验 精密移取“2.1.2.2”项下批号为PGEBH062的供试品溶液，在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、48 h后，依法测定样品中各待测成分峰面积积分值，薄荷脑、樟脑、桉油精、水杨酸甲酯、芳樟醇RSD分别为0.71%、0.86%、0.92%、1.16%、1.30%。结果表明供试品在48 h内稳定性良好。

2.1.8 加标回收率 精密称取薄荷脑对照品1.442 7 g、樟脑对照品0.283 3 g、水杨酸甲酯对照品1.960 3 g、桉油精对照品0.803 5 g、芳樟醇对照品0.110 7 g，置于同一10 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，制得混合对照品①，分别含薄荷脑、樟脑、水杨酸甲酯、桉油精、芳樟醇80.189 3 mg·mL-1、27.253 46 mg·mL-1、194.853 82 mg·mL-1、80.189 3 mg·mL-1、10.903 95 mg·mL-1。

取已知含量的和兴白花油(批号：PGEBH031)，精密量取0.5 mL，平行做6份，分别精密加入混合对照品①0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，依“2.1.2.2”项下制得供试品，按“2.1.1”色谱条件测定。平均回收率结果在95%～105%，RSD<3%,说明本法回收率结果可行。见表3。

表3 5种成分回收加标率 (%)

2.2 相对校正因子(RCF)耐用性考察

2.2.1 不同色谱柱耐用性考察 在同一色谱条件

下，分别用色谱柱1即厂牌为HP-INNOWAX序号为USD727711H(30 m×0.25 mm×0.25 um)和色谱柱2即厂牌为InertCap WAX序号为U1204i24(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱，取“2.2.2.1”项下混合储备液，精密移取5 mL,置25 mL容量瓶中，无水乙醇定容，各进样1 μL，测定。结果显示色谱柱1和色谱柱2所测得的内参物(薄荷脑)与其他组分(樟脑、水杨酸甲酯、桉油精、芳樟醇)之间的RCF的RSD分别为2.53、2.30、2.38、2.22，均小于5%，说明不同色谱柱条件下所测得的薄荷脑与其他待测组分的RCF耐用性较好。

2.2.2 不同仪器耐用性考察 在同一色谱条件下，分别用仪器1即厂牌为SHIMADZU型号为GC-2014编号为C1295气相色谱仪和仪器2即厂牌为SHIMADZU型号为GC-2010AF编号为C1743气相色谱仪，取“2.2.2.1”项下混合储备液，精密移取5 ml,置于25 ml容量瓶中，无水乙醇定容，各进样1 μL测定。结果显示仪器1和仪器2所测得的其他待测成分(樟脑、水杨酸甲酯、桉油精、芳樟醇)与薄荷脑之间的RCF的RSD分别为1.67%、2.33%、2.94%、2.12%，均小于5%，表明在不同仪器条件下所测得的薄荷脑与樟脑、水杨酸甲酯、桉油精及芳樟醇的RCF耐用性较好。

2.3 目标色谱峰的定位 针对在只使用单个对照品时， 如何正确定位和兴白花油中其余 4 个目标色谱峰的问题。本文分别引入采用各待测成分间的保留时间差、 分离度和相对保留值(待测成分与内标调整保留时间之比) 3 种参数作为定位标准，并在 2 种不同型号气相色谱系统和 2 根不同品牌的同类填料色谱柱下对这 3 个参数进行考察，比较结果显示，采用各待测成分间的相对保留值更能够准确定位上述目标色谱峰。

2.4 样品的测定 精密吸取1 μL“2.1.2.2”项下供试品溶液，注入气相色谱仪中，采用QAMS法和外标法依法(ESM)计算6批和兴白花油样品的含量，来验证QAMS法用于和兴白花油多指标质量评价的准确性，结果(见表4)显示，采用QAMS法及ESM测得的和兴白花油中桉油精、樟脑、芳樟醇、薄荷脑、水杨酸甲酯的含量值无显著性差异，RSD<3%，说明QAMS法的可信度较高，在和兴白花油的多成分质量评价中应用是可行的。

表4 桉油精、樟脑、芳樟醇、薄荷脑及水杨酸甲酯含量样品测定结果

3 结果与讨论

3.1 内参物的选择 实验选用薄荷脑作为内参物建立与和兴白花油其他有效成分间的RCF原因是：薄荷脑为和兴白花油的主要有效成分，对照品较其他成分相对廉价易得，含量也较高。

3.2 目标色谱峰的定位 在本实验的色谱条件下，由于和兴白花油色谱图中色谱峰图谱相对比较复杂，QAMS法待测组分色谱峰的定位方式有2类：其一是相对保留时间差值(△RT)或是相对保留比值来进行定位；其二适用于色谱柱之间误差大的情况，利用不同色谱柱下各组分与保留时间存在线性，推出回归方程，进行定位，但该方法应用少，还需进一步的研究。本实验中就是通过桉油精、芳樟醇、樟脑、薄荷脑、水杨酸甲酯之间的相对保留时间差进行定位，结果显示其RSD均远低于3%。这种定位方式使用于和兴白花油，在测定桉油精、芳樟醇、樟脑、薄荷脑、水杨酸甲酯5种成分的含量时，只需有薄荷脑对照品，即可通过QAMS法实现5种成分含量的同步含量测定。

该方法以薄荷脑成分为内参物，建立该成分与樟脑、水杨酸甲酯、桉油精、芳樟醇的相对校正因子，并计算这4种成分相对应的含量，与ESM测定白花油中5种成分的含量无显著性差异(RSD%<3%)，通过QAMS技术实现同步测定白花油中多指标成分，为白花油多指标质量控制模式提供新方法。