pH急性胁迫对方斑东风螺行为及免疫酶活性的影响

丁瑞霞，黄星美，赵 旺，邓正华，陈恒大，温为庚，马振华，王江勇,郑忠明

(1 天津农学院水产学院，天津 300384；2 三亚热带水产研究院，海南 三亚 572426；3 海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室，海南三亚，572426;4 中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300；5 惠州学院生命科学学院，广东 惠州 516007;6 宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315822)

方斑东风螺(Babylonia areolata)俗称香螺、花螺，属于腹足纲，蛾螺科，主要生长在中国东南亚和日本沿海，是热带和亚热带的海洋物种，也是中国东南沿海主要的养殖产品和经济贝类[1]。其营养丰富、肉质鲜美，是一种传统海味，深受人们的喜爱，市场容量较大。近年来，随着苗种繁育及养殖技术的突破与升级，方斑东风螺工业化养殖在中国东南沿海地区发展迅速[2]。

水环境在水生生物的生长繁殖中起着重要作用，而不适宜的环境则会抑制水生生物的发育、生长和繁殖。pH是水产养殖水环境的重要指标，过高、过低都会直接影响水产养殖生物的生长、摄食和代谢[3-4]。在贝类工业化的养殖过程中，大量的贝类死亡、藻类的过度喂养甚至海水的红潮都会降低水体的pH，而且在养殖过程中，为了净化水质，栽植大量的水生植物，由于光合作用，水中的二氧化碳(CO2)被大量消耗，导致水体pH增加[5]，pH的变化会对水生生物造成慢性或急性的应激，影响其活动及免疫功能[6-10]。方斑东风螺在中国南方沿海的养殖方式主要以露天陆地水泥池的流水养殖为主，水产养殖池pH的变化会对其生理和生长过程产生不同影响。酸性和碱性环境会降低幼贝的附着力，两壳紧密闭合、触手不伸出[11]。

本研究通过pH胁迫试验确定了方斑东风螺免疫活性的变化，更好地了解方斑东风螺的免疫反应，为深入研究方斑东风螺提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

据试验要求放入健康、大小均匀且活力强的方斑东风螺，观察活动和生存情况，试验过程中观察24 h内百分百死亡pH(LC100/24 h)和96 h内百分百无死亡pH(LC100/96 h)，据试验结果确定试验液pH的上、下限，然后用等间距方法分别设置了5.0～9.0等5个pH浓度梯度，利用氢氧化钠(NaOH)或者氯化氢(HCl)来调节至相应pH，使用pH分析仪测定相应的pH，并将已经配置好的海水储存在单独的水箱中。以自然海水pH=8.0为基础，用pH分析仪对水体的pH每天早晚各矫正一次，控制pH日变化幅度不超±0.2。每组处理均为3个平衡，并将30只健康活跃的螺放在每个实验容器(40 L)中。试验用螺质量相近，来降低试验差异性，整个试验过程中螺不会重复使用，并在试验期间停止投喂。

试验开始后，从6、12、24、48、72和96 h内随机选择每组3只方斑东风螺，检测每种免疫酶的活性。在这种情况下，每6 h从每个容器中取出水样，测量pH并及时调整到预定值。在试验中，对各试验组方斑东风螺的活动状况和死亡率进行持续观察和记录，评估死亡的标准是，螺肉向外翻，吻管向外突出，发白僵硬。

1.2.2 样品的处理

用0.2 mol/L的生理盐水以1∶2 的质量体积比研磨整个组织，将研磨液置于5 000 r/min、4 ℃下离心10 min，并将上清液置于洁净的EP(eppendorf)管中，-80 ℃冰箱内保存、备用，POD、CAT、ACP和GSH-PX活性的测定分别采用相关试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2.3 试验数据的处理分析

获得的数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，并使用SPSS 21.0 对试验结果进行统计学分析。先对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，若处理间有显著性差异，再用Duncan法对均值进行比较，显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。

2 结果

2.1 pH胁迫对方斑东风螺的行为及存活率的影响

在pH试验组中，随着pH的改变，方斑东风螺出现不同程度的应激反应。pH胁迫后，方斑东风螺主要表现为对外部刺激反应迟钝，运动缓慢，爬壁运动减少，沉到桶底，无法正立，身体硬死。方斑东风螺的死亡状态为发白僵硬，螺肉外翻，吻管向外伸出。pH=5.0的试验组在6 h时出现了行动缓慢、翻背，在72 h开始死亡，死亡率为13%。pH=9.0试验组在12 h出现翻背，其翻背率为50%至27 h出现死亡。其他pH试验组的方斑东风螺生活状况良好，存活率100%，仅有个别螺出现翻背的现象(见表1)。随着时间的推移，对照组的方斑东风螺也从最初的行动活跃到最后的行动缓慢、翻背。

表1 pH胁迫下方斑东风螺的行为和存活率影响

2.2 pH胁迫对方斑东风螺GSH-PX活性的影响

pH胁迫对方斑东风螺GSH-PX活性的影响如图1a所示。可以看出，不同pH的处理时间对方斑东风螺GSH-PX活力影响显著(P<0.05)，不同pH下GSH-PX活性短时间内无显著性差异(P>0.05)。在pH=5.0时，GSH-PX的活性先升高后又降低，并在48 h活性达到7.48 U/mgprot的峰值。同样的pH=8.0时，GSH-PX活性在6 h也达到了最大值9.44 U/mgprot。然而，GSH-PX活性在其他各试验组中随着时间的推移，GSH-PX显示出“诱导-抑制”的趋势。

2.3 pH胁迫对方斑东风螺CAT活性的影响

pH胁迫对方斑东风螺CAT活性的影响如图1b所示。可以看出，不同pH的处理时间对方斑东风螺CAT活力影响显著(P<0.05)，不同pH下CAT活性短时间内无显著性差异(P>0.05)。在pH=9.0时，CAT活性变化显著，在12 h试验组活性出现峰值，达到58.26 U/mgprot，随着时间的推移，活性逐渐降低；在pH=7.0时，试验组在6 h活性达到最低值15.23 U/mgprot。总体来看，随着时间的不断延长，各pH处理组CAT活性显示出 “诱导-抑制-诱导”的变化趋势。

2.4 pH胁迫对方斑东风螺POD活性的影响

pH胁迫对方斑东风螺POD活性的影响如图1c所示。可以看出，不同pH的处理时间对方斑东风螺POD活力影响显著(P<0.05)，不同pH下POD的活性短时间内无显著性差异(P>0.05)。当pH=7.0、8.0时，POD活力呈现先降低后升高最后降低的趋势，其他实验组POD活力均呈现为先升高后降低的趋势。当pH=9.0时，POD活力变化显著，在24 h活力出现峰值，达到15.19 U/mgprot，当pH=5.0时，试验组POD活力在96 h达到最低值，活力为5.03 U/mgprot。虽然各试验组POD活力的变化规律不同，总体看来，POD活性显示出“诱导-抑制”的变化趋势。

2.5 pH胁迫对方斑东风螺ACP活性的影响

pH胁迫对方斑东风螺ACP活性水平的主要影响如图1d所示。可以看出，不同pH的处理时间对方斑东风螺ACP活力影响显著(P<0.05)，当pH=5.0、8.0、9.0时，ACP的活性显著上升，并可于12 h达到最高，但随着时间的推移，ACP的活性逐渐出现抑制。pH=7.0时，ACP活性由6 h的最高值173.09 U/mgprot逐渐降低，后虽然随着时间的变化有所提高，但总体ACP活性仍然是受到抑制。pH=6.0时，ACP活性受到轻微抑制后随时间显著升高，在24 h时后又呈现抑制的现象。因此，低pH处理组(pH=5.0、6.0)ACP活性显示出“诱导-抑制”的变化趋势。

图1 pH胁迫对方斑东风螺免疫酶活性水平的主要影响

3 讨论

3.1 pH对方斑东风螺行为和存活率的影响

在适宜的环境条件下，水生生物体内的代谢会加强，有利于其生长发育。反之，会对水生生物产生代谢压力进而影响其生长[12-13]。pH作为一个重要的环境因子，其变化可能会导致水生生物的免疫能力受损甚至死亡[14]。本试验中，在pH为5.0、9.0处理72 h时的平均死亡率超过10%，在96 h的死亡率达到20%。试验发现，方斑东风螺的最适pH为8.0，其最高和最低的临界pH分别为9.0和5.0，超出这个临界范围，方斑东风螺的存活率会大大降低。这和刘洋等[15]的研究结果相似，不同pH对海湾扇贝(Argopectenirradians)胚胎发育的影响，随着pH的降低，存活率逐渐下降。水体pH会直接地影响水生生物代谢功能，造成其免疫系统受损、酸碱平衡紊乱、导致个体的死亡。覃玉莲等[16]研究低pH对小龙虾(Procambarusclarkia)免疫功能影响时发现，在低pH水环境条件下，时间越长，死亡率也就越高，这是因为小龙虾长期的处于酸性条件下，破坏了小龙虾的免疫系统从而影响小龙虾自身的修复功能，使其无法有效抵御疾病。本研究中，随着时间的延长，方斑东风螺在过高、过低pH下，死亡率都逐渐上升，这可能因为pH破坏了方斑东风螺的免疫系统，使其失去抵御外来病原体入侵的能力而死亡。

有研究表明，水生生物可以通过体内缓冲系统调节渗透压，使体内pH接近中性，维持机体酸碱平衡，使其能适应一定范围内外界pH的变化，但是，如果超过缓冲限值，机体的pH会发生显著变化，破坏体液的酸碱平衡，影响机体正常生理活动[17-18]。本研究结果表明，方斑东风螺对于pH有着一定程度的耐受性，因此在短时间内，pH过高或者过低，方斑东风螺仅仅表现出翻背，运动迟缓，并没有立即死亡，并且这与李健等[19]研究结果相似，pH胁迫对中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)死亡率有一定的影响，高和低pH胁迫都会使3种对虾的存活率随时间的延长而逐渐降低。梁从飞等[20]研究表明，pH升高会导致罗非鱼(Oreochromismossambicus)血清渗透压发生显著变化，从而破坏鱼类体内的酸碱平衡，对罗非鱼造成危害。本研究中方斑东风螺在高、低pH条件下均会出现翻背，这是因为在pH突变环境中方斑东风螺采取主动调节措施，维持体内离子和酸碱平衡，这既是机体的被动病理表现，也是主动的保护反应[21]，这跟荣小军等[22]研究的不适pH下海参(Holothuria)会出现身体蜷曲、棘刺收缩，粪便变细变短相类似。

3.2 pH对方斑东风螺个体免疫酶活性的影响

CAT和POD是动物体内重要的抗氧化酶，GSH-PX可以将过氧化氢(H2O2)分解成氢气(H2)和氧气(O2)，来有效阻止体内膜脂质细胞的过氧化，进而有效减缓膜细胞因氧化和应激而引起细胞的破坏。正常的状态条件下，CAT和POD可以与GSH-PX联合作用清除动物基体内存在的过氧反应性自由基，使得动物基细胞体内的自由基化合物的氧化形成过程和氧化消除过程达到一个动态的平衡，从而可以保证使其自身免遭有害自由基化合物的破坏[23-25]。研究发现，CAT和POD的活性越强，抗逆性也就越强，其消除自由基能力也越强。而当动物的生存环境发生变化，受到胁迫时，这两种酶的活性就会发生应激变化以适应新的环境[26-27]。该研究中，方斑东风螺受到pH胁迫CAT和POD的酶活性在短时间内显著上升，随着时间的延长这两种酶的活性又逐渐降低。这可能是因为方斑东风螺体内的CAT和POD产生适应环境的诱导反应，因此提高了这两种酶的活性，使其达到新的动态平衡。然而，随着时间不断延长，由于方斑东风螺初始产生的活性氧超过了其抗氧化系统的捕获能力，抗氧化系统无法及时捕捉自由基，从而导致氧化损伤，使得CAT和POD活性均降低或者丧失。GSH-PX具备单独去除过氧化物的能力，随时间延长，GSH-PX逐渐适应新的pH环境，当生物受到胁迫，体内脂质过氧化时，GSH-PX活性就会升高进而去清除体内的过氧化物。田立立[5]在研究pH胁迫克氏原螯虾(Pro-cambarusclarkii)时也发现，GSH-PX活性受到pH胁迫在短时间内迅速下降，而后又随着适应新环境而升高。这也与刘鹏飞等[28]研究凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)CAT和POD基因表达的机理相似。

ACP是参与动物免疫防御功能的主要水解酶，它也是吞噬细胞的主要成分[29]，主要来源于粒细胞颗粒，在细胞吞噬作用、钙磷代谢、体内蛋白质合成和磷酸基团转移等过程起重要作用[30]，它的活力变化是判断水产动物免疫力的重要指标[31-34]，因此在动物免疫学中ACP作为关键的免疫指标，长期以来一直被广泛研究。Suresh等[35]研究了铜离子(Cu2+)胁迫下贝类血细胞ACP活性变化，发现在低或者高pH胁迫下，ACP活性明显升高。本研究中，较低和较高pH条件下，方斑东风螺的ACP酶活性的变化也趋于相同，均是呈先缓慢上升后逐渐下降的态势，这是由于方斑东风螺处于pH变化的环境中，为维持自身体内酸碱平衡而采取的主动调节措施，也是一种被动的病理表现。当环境因子存在胁迫时，方斑东风螺的免疫功能将出现暂时的增强。也就是说，ACP活力提高是机体在病理条件下急性激活反应中免疫功能的表现，提高活性有助于保护机体并减少氧化损伤。这跟樊甄娇等[36]研究结果一致，pH对栉孔扇贝(Azumapectenfarreri)ACP活性都有明显的影响，随着pH急剧变化，ACP活性明显升高。当贝类受到损伤时，为防止外来病原生物入侵，激活溶酶体中以ACP为主的一系列水解酶，使这些酶活力大大提高[37-38]。由此看来，除了作为自身防御的反应外，ACP活力升高也被认为是一种被动病理表现。

4 结论

研究表明，pH对方斑东风螺免疫酶活性有显著影响，高pH和低pH水体养殖一段时间之后，都会表现出不能保持正立、腹面朝上、运动缓慢等状态，甚至还会导致方斑东风螺死亡。当受到重度pH胁迫时，方斑东风螺的GSH-PX、CAT、POD、ACP活性被抑制；当受到轻度pH胁迫时，免疫酶活性则被诱导。试验结果显示，在pH改变时，这些免疫酶活性变化得较特异，与方斑东风螺所处的发育阶段不同、抗逆能力较强、免疫能力强等生物习性有关。pH处理组中方斑东风螺免疫酶活力变化规律，很好地指引了养殖水体pH调控范围。未来对东风螺的进一步研究将考虑方斑东风螺对不同环境胁迫反应的种内变异性，以及种间差异性。

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