盐度胁迫对曼氏无针乌贼胚胎发育和生长性能的影响

黄伟卿，陈宇光，张 艺，乔 莹，马笑晚，周逢芳,2，阮少江,2，丁建发,2

(1 宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100；2 闽东水产品精深加工福建省高校工程研究中心，福建 宁德 352100；3 宁德市鼎诚水产有限公司，福建 宁德 352100；4 福建省闽东水产研究所，福建 宁德 352100；5 自然资源部第四海洋研究所“中国-东盟国家海洋科技联合研发中心”，广西 北海 536000)

曼氏无针乌贼(Sepiellamaindronide Rochebrune)属无针乌贼属，俗称墨鱼，在中国广泛地分布于黄海、东海等海域，浙江舟山是其主要原产区，与大黄鱼(Larimichthyscrocea)、小黄鱼(L.polyactis)和带鱼(Trichiuruslepturus)统称为中国的四大经济捕捞水产品[1-2]。曼氏无针乌贼浑身是宝：乌贼墨和海螵蛸是用于止血的中药材；内脏富含不饱和脂肪酸、脂溶性维生素和丰富的未知生长因子，常被用作动物饲料和添加剂，具有良好诱食和助消化作用；肌肉富含氨基酸、蛋白质等，具有较高的食用营养价值[3]。因其生长速度较快、养殖周期短和营养价值丰富等特点，21世纪初曼氏无针乌贼人工育苗技术被突破后，在浙江和福建等地已经进行规模化人工育苗和增殖放流，现已广受人民喜爱和青睐的养殖品种之一。

盐度作为水产养殖的重要理化因子，主要通过影响胚胎的渗透压平衡进而影响发育时长，当渗透压适宜时，胚胎内的渗透压会保持平衡，发育的速度较快，孵化率也较高，但当胚胎处在高渗透压的环境中时，胚胎发育时间将会大大缩短，但胚胎发育畸形的概率将会大幅度提高[4-8]。但经盐度胁迫也提高了鱼类[9]、虾类[10-12]、蟹类[13-14]、贝类[15-17]等水生动物的生长速度。目前，关于曼氏无针乌贼胚胎发育的研究主要集中在发育时序[18]和水温[19-21]的影响上，盐度胁迫对曼氏无针乌贼的生长发育的影响，仅见雷舒涵等[22]的研究，其结果表明盐度30有助于提高曼氏无针乌贼的孵化率，但关于曼氏无针乌贼胚胎发育能耐受的盐度范围和养成最适盐度，至今未见报道。曼氏无针乌贼主要养殖区域福建省宁德市在养殖过程中常受台风、暴雨等恶劣天气的影响，在室内水泥池进行曼氏无针乌贼育苗和养成生产过程中，因大暴雨导致养殖水体盐度突变，造成大量死亡现象。

本研究旨在探明盐度胁迫对曼氏无针乌贼的胚胎发育和生长的影响，为开展曼氏无针乌贼人工繁育、工厂化养殖和良种培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 受精卵来源

曼氏无针乌贼受精卵由宁德市南海水产科技有限公司提供，取同一时间产出的受精卵，从中挑选完成受精的黑色受精卵、剔除白色未受精的坏卵，平均卵径(0.8±0.15)cm，卵质量(0.21±0.05)g，受精卵采用活水车运输至宁德市鼎诚水产有限公司进行相关试验。

1.2 试验设计

在水温(22.5±1.5)℃，将曼氏无针乌贼的受精卵分别置于试验组，盐度分别为5(S5)、10(S10)、20(S20)、30(S30)和40(S40)，并以宁德地区野生曼氏无针乌贼生活海区水环境中盐度24(S24)为对照组，设置方式每组设置3个重复。盐度的调节以对照组盐度24为基础，采用经48 h曝气的自来水调制盐度为5、10和20，采用海水晶调制盐度为30和40。

将不同盐度组别的曼氏无针乌贼繁育子代进行人工养殖，研究盐度胁迫对其生长性能的影响，养殖技术与管理参考常抗美等[20]。试验期间，分别在5 d、10 d、15 d和30 d时，每组取30尾曼氏无针乌贼，分别采用游标卡尺(精度0.01 mm)测量胴体长和电子天平(精度0.001 g)称量体质量。

1.3 胚胎发育的观察

因曼氏无针乌贼的受精卵呈现出黑色不透明的形态，无法直接在体视显微镜下进行观察，因此观察前先将受精卵用镊子沿突出处小心的剥开，去除表层黑色的三级卵膜和乳白色的次级卵膜后，将胚胎放置于Leica DMS1000体视显微镜下进行观察并拍照，记录每个时期的发育进程，并描述形态变化。每次每组均随机取10个受精卵，观察时间和发育时序参考蒋敏霞等[18]的方法进行。

1.4 生物学统计

采用keys氏公式y=axb(a、b是拟合出来的系数)拟合胴长(x)与体质量(y)的生长式型[23]。

生长性能统计公式：

XAGR=(L2-L1)/(t2-t1)

(1)

XAGRW=(m2-m1)/(t2-t1)

(2)

XSGRW=(lnm2-lnm1)/t× 100%

(3)

式中：XAGR—绝对增长率(cm/d)；XAGRW—体质量绝对增加率(g/d)；XSGRW—体质量特定生长率(%/d)；m—体质量(g)；L—胴体长(cm)；t1、t2—试验初始、试验结束的时间，d；m1、m2和L1、L2分别为t1、t2时的体质量(g)和胴长(cm)。

1.5 数据分析

试验数据用(平均值±标准差)表示，采用SPSS 23.0处理软件中用单因素方差分析和Duncan’s多重比较进行显著性差异检验分析。

2 结果

2.1 胚胎发育的观察

曼氏无针乌贼的胚胎发育共分为受精卵期、卵裂期、囊胚期、原肠期、胚孔封闭期、原基出现期、外器官形成期、肌肉效应期、眼窝形成期、晶体形成期、心跳出现期、卵黄膜内的胚胎、体色素出现期、内骨骼形成期、尾腺出现期、缘膜出现期、刚出膜幼体17个阶段(表1，图1)。在水温(22.5±1.5℃)的范围内，曼氏无针乌贼完成整个胚胎发育过程需要时长19～20 d(表1)。

表1 曼氏无针乌贼的胚胎发育的时间以及各个时期的形态特征

2.2 盐度对曼氏无针乌贼胚胎发育的影响

水温(22.5±1.5)℃，盐度20～30范围时，胚胎发育时间随盐度的升高而缩短，试验组S30完成整个胚胎发育的时间最短为19 d 3 h，且孵化率为(90.5±4.4)%，显著高于其他组(P<0.05)，试验组S5、S10和S40分别在胚胎发育至2细胞期、16细胞期和原肠晚期后停止发育(表2)。

表2 盐度对曼氏无针乌贼胚胎发育的影响

2.3 盐度对曼氏无针乌贼生长性能的影响

分别拟合了1～30日龄试验组S20、S30和对照组S24的曼氏无针乌贼胴体长(x)与体质量(y)的生长式型，结果如下：

试验组S20:y=0.145 2x2.856 8(R2=0.950 8)；

试验组S30：y=0.131 7x3.271 2(R2=0.943 8)；

对照组S24：y=0.125 8x3.450 5(R2=0.945 8)。

三者b≈3，即在此生长环境下曼氏无针乌贼表现为等速生长(图2)。

图2 不同盐度曼氏无针乌贼生长式型

经30 d养殖后，试验组S30AGR、AGRW和SGRW分别为(0.12±0.02)cm/d、(0.33±0.12)g/d和(0.36±0.24)%/d，均显著高于其他组(P<0.05)(表3)。

表3 盐度对曼氏无针乌贼生长性能的影响

3 讨论

3.1 盐度对曼氏无针乌贼胚胎发育的影响分析

盐度的高低变化会影响海洋生物的渗透压，而绝大部分的海洋生物对外界的盐度变化都有调节机体本身渗透压的能力[24]，有研究发现，在一些贝类[25]和鱼类[9]的胚胎发育受盐度变化影响显著，盐度越高，完成胚胎发育的时间越快。本次试验结果同样表明，在盐度20～30时曼氏无针乌贼胚胎发育速度与盐度呈正比关系，这一结果与雷舒涵等[22]和陈四清等[26]的结果一致。但同时试验结果还发现当盐度达到40或盐度小于10时无法完成整个胚胎发育时序，主要原因可能是卵膜难以调节卵内外的物质平衡而导致受精卵损伤或代谢失调。

刘振勇等[19]研究结果发现，曼氏无针乌贼受精卵的孵化率在盐度22～30范围内随着盐度的升高而升高，孵化率在50%～90%之间，在盐度21时存活率极低。雷舒涵等[22]研究结果表明，在盐度15～30曼氏无针乌贼受精卵的孵化率随着盐度的升高而升高，在盐度30～36曼氏无针乌贼受精卵的孵化率随着盐度的升高而降低，孵化率在盐度30时达到最高，为77.8%，而其他盐度孵化率均低于50%。本研究同样证实，曼氏无针乌贼受精卵的孵化率在盐度30时达到最高值，低于或高于盐度30孵化率均出现下降趋势，这与陈四清等[26]研究一致，盐度突变对曼氏无针乌贼受精卵卵液渗透压的影响均极显著(P<0.01)。盐度由30向低盐处理突变时，受精卵卵液渗透压均显著降低，而向高盐处理组突变时，卵液渗透压则显著升高(P<0.01)。而渗透压的升高或降低均能导致卵膜难以调节细胞与周围介质之间的物质平衡而导致受精卵损伤或代谢失调所致，从而导致孵化率的降低。

3.2 盐度对曼氏无针乌贼生长性能的影响分析

养殖水体盐度变化是影响鱼类生存和生长的重要环境因子。郑伟刚等[27]研究表明，适宜的盐度有利于促进鱼类摄食、生长和饵料利用，但超过适宜范围时就会明显影响鱼类生长，这与盐度影响鱼类体内消化酶活性和能量分配等原因有关[28-29]。对于头足类动物，不同的种类对盐度的适应范围均有所差异，拟目乌贼(Sepialycidas)生长适宜的盐度是21～33，最适盐度为27～30[30]；长蛸(Octopusvariabilis)生长的适宜盐度范围为16.3～27.3，最适盐度在18.3～24.3[31]；金乌贼(Sepiaesculent)生长的适宜盐度范围24～37[26]；虎斑乌贼(Sepiapharaonis)幼体生长的适宜盐度范围18～33，最适盐度24～27[32]。本研究曼氏无针乌贼在盐度20～30范围内生长适宜，最适盐度为30，较尹飞等[33]研究指出曼氏无针乌贼盐度的适应范围11.73～31.43，最适盐度19.61～26.18，盐度有所差别，原因主要是曼氏无针乌贼为了适应养殖区域环境，长期经受驯化所产生了差异。

3.3 关于曼氏无针乌贼的生长式型

目前关于曼氏无针乌贼的生长式型拟合较少，本次试验拟合了不同盐度下1～30日龄的胴体长(x)与体质量(y)的生长试型，结果与黄伟卿等[23]、蒋敏霞等[18]和张建设等[21]的拟合结果一致，回归方程中b值均接近3，且R2值较高，拟合度较好，均表现出等式生长的情况。焦海峰等[34]、姬广闻[35]研究表明，盐度与水产动物的各种生理活动关系密切,水生生物对盐度都有一定的适宜范围，超出适宜范围可导致其自身与外界水体的渗透压出现差异，需要消耗更多能量来维持渗透压平衡，以至于用于其他方面的能量减少，会影响其生长性能，超过其自身调节能力时可导致死亡。而曼氏无针乌贼同其他无针乌贼一样,幼体对盐度的耐盐性随着日龄的增长而增强，这与其生理机能日渐完善，对渗透压的调节能力逐渐加强有关[36]。因此随着曼氏无针乌贼的生长，曼氏无针乌贼长时间对当地养殖盐度的适应，从而导致不同区域养殖的盐度变化所拟合生长模型均存在差异。

4 结论

本研究将曼氏无针乌贼的胚胎发育时序分为17个阶段，在水体盐度30中完成整个胚胎发育的时间最短、且孵化率为最高，养殖周期30 d其体质量绝对增加率、绝对增长率和体质量特定生长率分别为(0.33±0.12)g/d、(0.12±0.02)cm/d和(0.35±0.24)%/d，显著大于对照组(P<0.05)，且生长模式表现为等式生长的规律，结果证明在养殖水体盐度30更适宜曼氏无针乌贼生长发育。这一结构将对今后开展曼氏无针乌贼室内苗种培育和进行可控的循环水养成技术具有重要的指导意义。

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