一株可分解钾长石真菌的分离筛选及鉴定
2022-12-29薛永萍谢婷婷池汝安
薛永萍，汤 璐，冯 健，谢婷婷*，池汝安*
(1.武汉工程大学邮电与信息工程学院，湖北 武汉 430074；2.武汉工程大学兴发矿业学院，湖北 武汉 430074)
全球可溶性钾资源非常丰富，但分布极其不均，我国仅占世界总储量的2.2%[1]。因此，我国每年需进口大量钾肥。值得庆幸的是，我国钾长石矿物资源极为丰富，将钾长石矿物中的难溶性钾转化为速效钾，可有效解决我国可溶性钾资源匮乏问题。目前，常采用物理法、化学法和微生物法提取钾长石矿物中的难溶性钾[2]，其中物理法和化学法易产生环境污染、生态安全和食品安全等系列问题，而微生物法能突破钾长石矿物资源难以利用的技术瓶颈，为钾长石的开发利用开辟了新途径。李春钢等[3]从贵州福泉瓮福磷矿矿区土壤中分离得到了一株能有效提高煤矸石中有效钾含量的新菌株；宋淼等[4]对草酸青霉分解钾长石进行了研究，发现草酸青霉在一定条件下具有较强的解钾能力。这些研究成果促进了我国难溶性钾资源的进一步开发利用，为微生物法分解钾长石矿物提供了理论支撑和技术指导，但这些研究仅阐明了硅酸盐微生物可分解钾长石矿物，但解钾能力不强且未对解钾机理进行研究。基于此，作者从某钾长石矿区作物根系土壤中分离筛选可分解钾长石的真菌，利用18S rRNA序列分析对其进行鉴定，同时分析其最适生长条件，探讨其生长代谢特性，揭示其解钾机理。
1 实验
1.1 材料与培养基
土样，取自某钾长石矿区作物根系土壤；钾长石，用去离子水浸泡24 h，然后用3.0 mol·L-1盐酸浸泡72 h，再用去离子水洗涤3～5次至pH值呈中性[5]。
基础培养基：葡萄糖10 g，磷酸氢二钾0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸亚铁0.002 g，硫酸锰0.2 g，氯化钙0.2 g，硫酸铵0.3 g，二次蒸馏水1 000 mL，调pH值至6.0。
解钾培养基：葡萄糖10 g，钾长石矿粉4 g，氯化钠0.2 g，硫酸镁0.2 g，氯化钙0.2 g，硫酸锰0.2 g，硫酸铁0.002 g，蒸馏水1 000 mL，调pH值至6.0。
1.2 分解钾长石真菌的分离筛选
富集培养：称土样10 g，加入100 mL无菌水，充分搅拌，纱布过滤；准确吸取5 mL滤液置于装有50 mL基础培养基的三角瓶中，于35 ℃、180 r·min-1摇床培养2 d；吸取5 mL培养液置于装有50 mL基础培养基(减少了磷酸氢二钾用量)的新的三角瓶中，于相同条件下进行富集培养。
菌种筛选：吸取200 μL经多次富集后的澄清菌液，涂布于解钾培养基，于35 ℃恒温培养，并进行多次分离纯化。
1.3 分解钾长石真菌的形态分析与种属鉴定
通过显微镜观察筛选得到的分解钾长石真菌的菌落形态，并进行种属鉴定。鉴定引物为：SN1：5′-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3′，SN2：5′-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3′；经与NT数据库比对，鉴定菌株的种属[6-7]。
1.4 分解钾长石真菌的生理生化性能测试
通过柠檬酸盐作用实验、硫化氢产生实验、明胶水解实验、淀粉水解实验、硝酸盐还原实验、甲基红反应、吲哚实验、过氧化氢酶实验、乙酰甲基甲醇实验等测试分解钾长石真菌的生理生化性能[5,8]。
1.5 分解钾长石真菌的解钾机理探究
分别采用X-射线衍射仪和高效液相色谱仪对真菌分解前后的矿粉组成和分解后的代谢产物进行分析，以阐明分解钾长石真菌的解钾机理。
2 结果与讨论
2.1 JX-24菌株的形态
从矿区土壤中分离筛选到一株可分解钾长石矿物的真菌，命名为JX-24。其显微镜照片如图1所示。
图1 JX-24菌株的形态(放大100倍)Fig.1 Morphology of strain JX-24(×100)
从图1可知，JX-24菌株表面透明、光滑、隆起突出，且解钾圈明显(图1a)；染色后，可明显看出JX-24菌株为菌丝较粗且交错有分隔、分生孢子呈椭圆形的“扫把型”真菌类微生物(图1b)。
2.2 JX-24菌株的种属
对JX-24菌株进行18S rRNA序列分析，并利用MEGA 4.0软件绘制JX-24菌株的系统发育树，进而确定JX-24菌株种属，结果如图2所示。
图2 JX-24菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain JX-24
从图2可知，分离筛选得到的JX-24菌株为枝孢菌(Cladosporiumsp.)，且与MT093667.1的同源相似性高达99.36%。
2.3 JX-24菌株的最适生长条件
微生物的生长繁殖与其赖以生存的环境密切相关，除了维持微生物生长的营养成分外，温度和pH值起着至关重要的作用[9-10]。分别在温度为10～50 ℃、pH值为1.0～10.0的条件下培养JX-24菌株，考察JX-24菌株的最适生长温度和最适生长pH值，结果见表1。
从表1可知，JX-24菌株的最适生长温度为35～40 ℃，最适生长pH值为6.0。
表1 JX-24菌株在不同温度和pH值下的生长情况
2.4 JX-24菌株的生长代谢特性
JX-24菌株的生理生化性能测试结果见表2。
从表2可知，JX-24菌株为好氧型真菌类微生物，可进行明胶水解、淀粉水解，但吲哚实验、过氧化氢酶实验、乙酰甲基甲醇实验、甲基红反应等均为阴性[11-12]。
表2 JX-24菌株的生理生化性能
分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、木糖醇和木糖为培养基碳源培养JX-24菌株，并用于钾长石的分解，以溶液中可溶性钾离子含量及钾浸出率为指标，考察碳源对JX-24菌株解钾效率的影响，结果如图3所示。
从图3可知，JX-24菌株可较好地利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、木糖醇和木糖；在同等条件下，不同碳源对JX-24菌株解钾效率影响较大。当分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、木糖醇和木糖为碳源时，溶液中可溶性钾离子含量分别为27.12 mg·L-1、24.47 mg·L-1、20.12 mg·L-1、17.77 mg·L-1、16.24 mg·L-1、12.02 mg·L-1和10.77 mg·L-1，钾浸出率分别为9.72%、8.77%、7.21%、6.37%、5.82%、4.31%和3.86%，其中，以葡萄糖为碳源时，获得的JX-24菌株分解钾长石矿物的能力最强。因此，选择葡萄糖为最佳碳源培养可分解钾长石真菌。
图3 碳源对JX-24菌株解钾效率的的影响Fig.3 Effect of carbon source on potassium-dissolving efficiency of strain JX-24
分别以硫酸铵、硝酸钠、酵母菌、蛋白胨、赖氨酸和亮氨酸为培养基氮源培养JX-24菌株，并用于钾长石的分解，以溶液中可溶性钾离子含量及钾浸出率为指标，考察氮源对JX-24菌株解钾效率的影响，结果如图4所示。
图4 氮源对JX-24菌株解钾效率的的影响Fig.4 Effect of nitrogen source on potassium-dissolving efficiency of strain JX-24
从图4可知，JX-24菌株可较好地利用无机氮硫酸铵和硝酸钠以及有机氮酵母菌、蛋白胨、赖氨酸和亮氨酸；在同等条件下，不同氮源对JX-24菌株解钾效率影响较大。当分别以硫酸铵、硝酸钠、酵母菌、蛋白胨、赖氨酸和亮氨酸为氮源时，溶液中可溶性钾离子含量分别为：27.04 mg·L-1、23.74 mg·L-1、19.73 mg·L-1、17.88 mg·L-1、15.04 mg·L-1和11.83 mg·L-1，钾浸出率分别为9.69%、8.51%、7.07%、6.41%、5.39%和4.24%，其中，以硫酸铵为氮源时，获得的JX-24菌株分解钾长石矿物的能力最强。因此，选择硫酸铵为最佳氮源培养可分解钾长石真菌。
2.5 JX-24菌株的解钾机理
微生物不同，其分解钾长石矿物的代谢产物也不同，分泌量也不尽相同，所以微生物的解钾机理相对复杂，是一个多元化综合过程。为了阐明JX-24菌株分解钾长石矿物的作用机理，对分解前后的矿粉组成和分解后的菌株代谢产物进行分析，结果分别见表3、4。
表3 钾长石矿物经JX-24菌株分解前后的组成分析结果/%
从表3可知，钾长石矿粉经JX-24菌株溶蚀后，其组成含量变化明显，尤其是微斜长石含量由分解前的39%降至21%。证实钾长石矿物中的氧化钾被JX-24菌株分解。
表4 JX-24菌株分解钾长石矿物后的代谢产物分析结果
从表4可知，JX-24菌株在分解钾长石矿物的过程中代谢产生了柠檬酸、草酸和葡萄糖酸，其中较多的是柠檬酸。同时，也对JX-24菌株代谢产物胞外多糖(EPS)进行了测定，发现胞外多糖的含量较高，为2.86 mg·L-1。
图5 JX-24菌株分解钾长石矿物的历程Fig.5 Dissolving process of potassium feldspar by strain JX-24
3 结论
从某钾长石矿区作物根系土壤中分离筛选到一株可分解钾长石的真菌JX-24，经18S rRNA序列分析，鉴定其为枝孢菌(Cladosporiumsp.)，与MT093667.1的同源相似性高达99.36%；菌株JX-24属于好氧型真菌，以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源，最适生长温度为35～40 ℃，最适生长pH值为6.0；菌株JX-24对钾长石中微斜长石分解行为显著，其主要通过代谢产生的胞外多糖及微生物-矿物复合体的协同作用溶蚀矿物，破坏矿物晶格，进而释放钾离子。
(致谢:本研究测试分析工作得到了武汉工程大学测试中心、武汉理工大学分析测试中心和中国地质大学分析测试中心的支持和帮助，在此表示感谢！)
