体外抗氧化活性评价方法的反应机理研究进展

曾文俊，吕彩梦，丁建宝，李艳萍，马建龙，杨 锐，杨 晋,4*

(1.北方民族大学化学与化学工程学院，宁夏 银川 750021；2.国家民委化工技术基础重点实验室，宁夏 银川 750021；3.宁夏五行科技有限公司,宁夏 银川 750001；4.宁夏天然药物工程技术研究中心，宁夏 银川 750021；5.宁夏大学化学化工学院，宁夏 银川 750021)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)自由基是引起基因突变的活性小分子原子基团，也是引起机体氧化应激(oxidative stress，OS)的主要因素。正常情况下，人体内自由基的产生和清除是一个动态的平衡，当平衡被破坏，自由基在体内累积过多时，会损伤蛋白质、DNA和脂质过氧体等生物分子，引发各种疾病，如动脉粥样硬化[1-2]、心血管疾病[3]、糖尿病[4-5]、肿瘤[6-7]、癌症[8]等。一般认为，自由基氧化反应是包含自由基的产生、传递及终止等多个步骤的链式反应，反应式如下：

R·+O2→ROO·

自由基的传递：RH+ROO·→ROOH+R·

ROOH→RO·+·OH

R·+R·→R-R

自由基的终止：R·+ROO·→ROOR

ROO·+ROO·→ROOR+O2

研究表明，抗氧化剂可以通过抑制自由基生成或阻断自由基链式反应来实现抗氧化作用。抗氧化剂的研究思路[9]一般是通过抗氧化活性评价筛选出有益人体健康的化合物，体外抗氧化实验不仅没有以动物为模型的体内抗氧化实验存在的生命伦理等诸多问题，而且能较为准确地反映抗氧化剂的抗氧化能力，可帮助研究人员筛选出合适的抗氧化剂，是目前普遍使用的方法。目前，体外抗氧化活性评价方法主要有化学分析法和细胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity，CAA)法，不同评价方法的实验原理、适用范围各不相同，所得结果也有差异。作者在此对常用的体外抗氧化活性评价方法的反应机理研究进展进行综述，为准确评价抗氧化活性提供参考。

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1 化学分析法

根据抗氧化方式，可以将化学分析法分为还原能力测定、自由基清除能力测定、溯源抑制作用测定等。

1.1 还原能力测定

抗氧化剂可以通过提供电子的形式清除自由基，因此抗氧化活性可用还原能力表示，即以相当于标准物质的还原能力的量表示。还原能力越强，抗氧化活性就越高。

还原能力测定，是利用抗氧化剂的还原性将高价金属离子还原成低价金属离子，在相应显色剂作用下表现出光学差异，以此反映还原能力。根据金属离子的不同，还原能力测定可以分为铁离子还原能力(ferric reducing antioxidant power，FRAP)测定、铜离子还原能力(cupric reducing antioxidant capacity，CUPRAC)测定[10-11]和普鲁士蓝法[12-13]，最常用的是FRAP法。FRAP法最早被用于测定血浆的还原能力[14]，后被广泛用于天然植物抗氧化剂的还原能力测定[15-18]，作为评价抗氧化活性的标准之一。此外，用于测定总酚含量的福林酚法[19]也被用于测定还原能力，所以抗氧化剂的还原能力与多酚含量呈正相关，且相关系数较高[20-21]。

用还原能力评价抗氧化活性只能说明抗氧化剂具有还原能力，能够向缺电子自由基提供质子，但不能直接说明抗氧化剂是通过清除自由基来表现抗氧化活性。因此，还原能力测定常与自由基清除能力测定联合使用，来评价抗氧化剂的活性是否通过电子转移(electron transfer，ET)途径清除自由基实现。

1.2 自由基清除能力测定

自由基清除能力测定，是在自由基溶液中加入抗氧化剂，根据所产生的光学差异来反映抗氧化活性。自由基清除能力测定是最常用的抗氧化活性评价方法，其反应机理有电子转移[22-23]、氢转移(hydrogen atom transfer，HAT)及脂质过氧化抑制机制。

1.2.1 基于电子转移的自由基清除能力测定

自由基的种类可分为氮自由基和氧自由基。基于电子转移的自由基清除能力测定主要有ABTS法、DPPH法、PTIO法和·OH法等，由于ABTS自由基在水与醇溶液中有良好的溶解性，因此ABTS法可用来评价绝大多数抗氧化剂的活性[24-25]；DPPH自由基是醇溶性自由基[26]，因此DPPH法仅能用来评价醇溶性或者样品量相对较少的水溶性抗氧化剂的活性，且当水溶性抗氧化剂的量较多时，可能会产生絮状漂浮物，特别是多糖类抗氧化剂[27]。PTIO自由基是水溶性的一氧化氮自由基，PTIO法是近几年开发的抗氧化活性评价方法，已被Li[28]证实可用于评价大多数抗氧化剂的活性。ABTS、DPPH、PTIO自由基的清除机理(图1)均为：过氧自由基(ROO·)溶液在抗氧化剂(以抗坏血酸为例)的作用下，得到电子或/和发生质子转移从而被清除[29-30]，而自由基溶液会发生颜色变化，据此可评价抗氧化剂的活性。

图1 ABTS、DPPH、PTIO自由基的清除机理Fig.1 Scavenging mechanism of ABTS,DPPH,and PTIO free radicals

(1)

(2)

2半脱氢抗坏血酸+2H2O+Fe2+

(3)

1.2.2 基于氢转移的自由基清除能力测定

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法是一个经典的基于氢转移的自由基清除能力测定方法，是利用自由基产生剂(AAPH)产生氢过氧自由基，与荧光物质3′，6′-dihydroxy spiro[isobenzo furan-1[3H]，9′[9H]-xanthen]-3-one(FL)反应生成非荧光物质FL4，整个过程可以用FL的过氧化机制(图2)阐明[38]。抗氧化剂可以抑制或消除氢过氧自由基以减少FL4的生成，从而产生光学差异，基于抗氧化活性与荧光衰退曲线延缓部分面积(Net AUC)相关(图3)来评价其抗氧化活性，结果一般以ORAC值表示[39]。

图2 FL的过氧化机制Fig.2 Peroxidation mechanism of FL

图3 抗氧化活性与荧光衰退曲线延缓部分面积(Net AUC)的关系曲线Fig.3 Relationship curve of antioxidant activity and Net AUC of fluorescence decay curve

总自由基清除能力(total radical-trapping antioxidant parameter，TRAP)法的反应机理与ORAC法相同，但该法的荧光底物是R-藻红蛋白，抗氧化活性与荧光衰退曲线最大斜率的滞后期相关[40]。

此外，基于氢转移的自由基清除能力测定方法还有β-胡萝卜素漂白法[43-44]，即β-胡萝卜素亚油酸体系中的亚油酸会发生自氧化产生自由基使β-胡萝卜素褪色，而抗氧化剂会延迟褪色时间，基于吸光度的变化可评价抗氧化活性，结果一般以抑制率表示。

1.2.3 基于脂质过氧化抑制机制的自由基清除能力测定

脂质中的不饱和脂肪酸自氧化生成不稳定的脂质过氧化物，再进一步分解产生ROS、氢过氧化物及丙二醛等一系列自由基，这些自由基会引起细胞膜功能障碍、生物酶活性降低、细胞成分降解，导致细胞氧化损伤，与人体的动脉粥样硬化、高血糖、高血脂等心脑血管疾病的发生发展密切相关[45-47]。在评价抗氧化剂的体外抗氧化活性时，最常用的是脂质过氧化抑制实验：以小鼠肝脏匀浆[48]、小鼠肝脏线粒体悬浮液[49]或鸡蛋黄匀浆[50]作为脂质源，氧化分解产生丙二醛及其类似物，采用硫代巴比妥酸反应法测定，而抗氧化剂会抑制丙二醛及其类似物的生成，致使反应溶液的吸光度发生改变，基于空白组与实验组之间的光学差异来评价抗氧化剂的抗氧化活性。

1.3 溯源抑制作用测定

溯源抑制就是追溯本源，抑制上游氧化酶活性，减少ROS等自由基的生成，抑制氧化反应的发生，从而达到抗氧化的目的。当下研究热点是黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)，在核酸的分解代谢中，XOD不仅会催化黄嘌呤与次黄嘌呤氧化生成尿酸，而且能够产生超氧阴离子和过氧化氢等过氧化物自由基，因此抑制XOD活性能够间接减少体内自由基的生成[51]。在评价抗氧化剂的体外抗氧化活性时，常以黄嘌呤为底物、XOD为反应剂，XOD催化黄嘌呤产生的尿酸于290 nm处显示特征吸收峰，而抗氧化剂会抑制XOD的活性，减少尿酸的生成，致使吸光度发生变化，基于空白组与实验组之间的光学差异来评价抗氧化剂的抗氧化活性，结果一般以抑制率[52-53]或相对活性[51]表示。

2 细胞抗氧化活性法

CAA法是以细胞培养为基础的活性评价方法，用来研究抗氧化药物分配进入细胞膜、被吸收、与载体或酶等生物大分子相互作用、清除细胞内氧自由基的有效方法，能更准确、更接近地阐述抗氧化药物在生物体体内的抗氧化反应机理，比化学分析法更具生物相关性。CAA法率先由Wolfe等[54]以人肝癌细胞HepG2为模型提出，其反应机理如图4所示。

图4 细胞抗氧化活性法的反应机理Fig.4 Reaction mechanism of cellular antioxidant activitymethod

HepG2细胞用抗氧化剂(AOX)与本身无荧光的指示剂2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)的混合物预处理；抗氧化剂结合在细胞膜上，并通过细胞膜进入细胞；DCFH-DA扩散到细胞中，细胞酯酶裂解二乙酸部分，在细胞内形成极性更强的还原型二氯荧光素(DCFH)；然后用2，2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(ABAP)处理细胞，ABAP能够扩散到细胞中产生ROO·；ABAP能自发分解产生ROO·，ROO·攻击细胞膜产生更多的自由基或ROS；细胞内的DCFH极易被ROO·和ROS氧化为有荧光的氧化型二氯荧光素(DCF)。抗氧化剂可在细胞外清除或结合ROO·，并且能清除或结合细胞内的ROO·和ROS,防止DCFH的氧化，减少DCF的形成，基于空白组与实验组之间的光学差异来评价抗氧化剂的抗氧化活性。

在CAA法建立后，许多研究小组在此基础上，使用不同的致伤剂建立氧化应激模型，如张业尼等[55]和Zhao等[56]建立了以过氧化氢诱导HepG2细胞的氧化应激模型；龚业滔等[57]建立了以乙酰氨基酚诱导HepG2细胞的氧化应激模型。此外，为了更好地模拟抗氧化剂作用机体的效果，往往会根据抗氧化剂作用机理和目标作用部位，选择特定的细胞株，如人肝细胞L02[58-59]、人结肠癌细胞Caco-2[60-61]等。

3 结语

不同评价方法的实验原理、适用范围各不相同，所得结果也有差异。化学分析法较CAA法简单，实验周期短，但不能全面反映抗氧化剂的活性及其在生物细胞内的吸收、代谢和利用等情况。若要准确地评价抗氧化活性，需同时采用多种方法。如将不同自由基清除能力相结合、化学分析法与CAA法相结合等，以综合评价抗氧化活性。此外，还必须结合抗氧化剂的作用部位、溶解性等诸多因素选择评价方法，从而客观、准确地评价抗氧化活性。