EHF 通过抑制Wnt/β-catenin 通路活性下调胰腺癌细胞的干性*

王昊天 段晶晶 陈幸运 高春涛

E26 转化特异性同源因子（E26 transformationspecific homologous factor，EHF），又名上皮特异性转化因子3（epithelium-specific ETS factor family member 3，ESE3），是ETS 超家族中的一员，广泛存在于细胞核内，属于转录调控因子。EHF 在胰腺癌、前列腺癌中均发挥抑癌作用[1-4]。最新研究发现EHF 可下调胰腺癌细胞的干性[5]，而干性是导致胰腺癌耐药及进展的重要原因[6-7]，提示有望针对EHF 通路探索治疗胰腺癌的新方法。基于此，本研究通过生物信息学分析，结合分子生物学实验及经典的干性功能学实验[8]探讨EHF 调控胰腺癌细胞干性的具体机制，以期为探索胰腺癌治疗新靶点提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 胰腺癌细胞系 BXPC-3 及PANC-1 购自中国科学院上海细胞库，MIA PaCa2 及SW1990 购自美国American Type Culture Collection（ATCC）公司。

1.1.2 主要试剂及仪器 EHF 抗体（货号LS-C30726）购自美国LifeSpan Biosciences 公司；GADPH 抗体（货号RM-2005）购自中国北京锐抗生物科技有限公司；β-catenin 抗体（货号YM3345）、c-myc 抗体（货号YT0991）、CD44 抗体（货号YM6155）购自美国Immunoway 公司；PE-Cy7 标记的ESA 抗体（货号9C4）、FITC 标记的CD24 抗体（货号ML5）以及APC 标记的CD44 抗体（货号BJ18）购自美国Biolegend 公司；GFP 标记的EHF 过表达和敲低的病毒液购自中国北京奥科鼎盛生物科技有限公司；Polybrene 购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；Wnt/β-catenin 通路抑制剂XAV939 购自美国MedChemExpress 公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA 裂解液购自中国碧云天生物科技公司；Trizol Regent、逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix 和RNA 荧光定量检测试剂盒均购自日本Takara 公司；ChIP 试剂盒购自瑞士Roche公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega 公司；带有目标基因片段的PGL3 荧光素酶质粒及海肾质粒购自中国吉凯基因公司；Western Blot 化学发光成像仪购自中国深圳佰思恒科技有限公司；CFX96 Real time PCR 反应仪购自美国Bio-Rad 公司；流式细胞仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；普通倒置显微镜购自日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 EHF 过表达及敲低细胞系构建 利用PANC-1 细胞构建EHF 稳定过表达细胞系，利用SW1990 细胞构建EHF 稳定敲低细胞系。通过感染EHF 过表达和敲低的病毒，继而以嘌呤霉素药筛的方法构建EHF外源性过表达及敲低细胞系。

1.2.2 蛋白提取及Western blot 利用RIPA 裂解液进行细胞蛋白的提取。Western blot 具体步骤同常规实验。

1.2.3 RNA 提取、反转录及RT-qPCR 利用Trizol裂解液提取细胞RNA，使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。按照试剂盒说明书构建RT-qPCR 体系上机检测。引物序列见表1，基因的相对表达水平用2-ΔΔCt法计算。

表1 RT-qPCR 的引物序列

1.2.4 流式细胞术 将实验细胞进行消化、计数、清洗后，避光条件下加入binding buffer 及流式抗体，室温孵育半个小时后清洗细胞，移入流式检测管内，避光保存于4℃冰箱内，在24 h 内上机检测。

1.2.5 悬浮细胞成球 将实验细胞进行消化及计数，将5 000 个细胞均匀加入含有2 mL 干性培养基的低粘附6 孔板内，保证细胞不成团且均匀悬浮分布，每3 d 添加500 μL 干性培养基，约14 d 后用普通倒置显微镜进行采图，计算干性细胞球的细胞成球率（sphere formation efficiency，SFE）：每个孔中形成的干性球总数/每孔细胞数总数×100%。实验重复三次，计算平均值。

1.2.6 软琼脂克隆形成 将培养基与1.2%的琼脂糖液按1∶1 比例混合，取1 mL 迅速铺于6 孔板内，待其凝固。取500 个目标细胞与2×全培养基及0.7%的琼脂糖液进行混合（后两者按1∶1 的比例提前混合），随后将含有细胞的混合液均匀铺至已经凝固的下层凝胶上，等待上层凝胶慢慢凝固。凝固后，在表面均匀滴加500 μL 2×全培养基，随后每3d 滴加500 μL 2×全培养基。14d 后观察克隆形成的数量和大小，计算克隆形成率（colony formation efficiency，CFE）。每50 个细胞形成的集落认为是1 个单克隆，计数每个孔中克隆总数/孔中细胞总数×100%即得单孔的克隆形成率。实验重复三次，计算平均值。

1.2.7 ChIP 实验 按照试剂盒说明书进行实验，EHF 结合序列的PCR 引物为：β-catenin-F：5，-CGCCTT ACCACCCACCAAG-3，，β-catenin-R: 5，-GGCATATC GTTGTGCCAGGT-3，。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 按照试剂盒说明书进行实验，重复三次，计算平均值。

1.3 生物信息学分析

下载TCGA 数据库中的胰腺癌数据，通过DAVID 网站及KOBES 网站进行EHF 差异基因的功能富集分析及KEGG 通路富集分析[9]，在前十位分子通路中寻找与胰腺癌细胞干性相关的信号通路。在此基础上继续利用基因探针富集分析（GSEA）[10]对TCGA中胰腺癌数据进行计算，进一步验证EHF 与KEGG富集出的干性相关通路是否存在相关性。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 生物信息学分析发现Wnt/β-catenin 通路参与EHF 对胰腺癌细胞干性的调控

通过KEGG 通路分析，发现在富集出的与EHF相关的前十位分子通路中，与胰腺癌细胞干性相关的为位列第五位的Wnt/β-catenin 通路（图1A），该通路为经典的干性通路[11]。在此基础上，GSEA分析提示EHF mRNA 水平与Wnt/β-catenin 通路的活性呈负相关，差异具有统计学意义（P＜0.01，图1B）。

图1 胰腺癌EHF 表达与Wnt/β-catenin 通路存在相关性

2.2 胰腺癌细胞EHF 的表达水平与Wnt/β-catenin通路的活性呈负相关

选取4 种常用的人源胰腺癌细胞系BXPC-3、PANC-1、MIA PaCa2 以及SW1990 进行常规培养，检测其EHF 的基础表达量。PANC-1 细胞及MIA PaCa2 细胞EHF 基础表达量低，后续利用PANC-1细胞构建外源性EHF 稳定过表达的细胞系；BXPC-3细胞及SW1990 细胞EHF 基础表达量高，后续利用SW1990 细胞构建外源性EHF 稳定低表达的细胞系。进而以上述细胞系为基础探讨EHF 对Wnt/β-catenin 通路活性的影响（图2A）。Wnt/β-catenin 通路中有多个重要分子，如β-catenin、c-myc、Cyclin D1、CD44、TCF-1[12]，本研究最终选择β-catenin、c-myc 及CD44作为代表Wnt/β-catenin 通路活性的指标。前两个蛋白是研究Wnt/β-catenin 通路最常用的蛋白，而考虑到本研究选取CD44 作为胰腺癌细胞干性特征的标志物，故CD44 的表达也用于反映Wnt/β-catenin 通路的活性。通过Western blot 及RT-qPCR 实验，证实EHF的表达水平与代表Wnt/β-catenin 通路活性的因子βcatenin、c-myc 及CD44 的表达呈负相关，差异具有统计学意义（均P＜0.01，图2B，2C）。

2.3 EHF 直接调控β-catenin 的转录

为了探索EHF 与β-catenin 的相关性是否由EHF的转录调控所引起，首先利用JASPAR 和UCSC 两个在线数据网站预测β-catenin 启动子区可能存在的与EHF 发生结合的高分序列（图2D），随后利用ChIP 实验发现EHF 可结合于β-catenin 启动子区（图2E）。为进一步证实这种空间结构上的结合可引起转录改变，本研究进行了双荧光素酶报告基因实验。无论在293T 细胞还是在胰腺癌细胞中，将β-catenin 启动子区全长序列的质粒导入后，在外源EHF 质粒的刺激下，荧光强度明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.001，图2F）。而将β-catenin 启动子区中EHF 结合位点突变后的质粒导入后，即使给予同样的外源性EHF 质粒刺激，荧光强度较对照组也无明显变化（P＞0.05）。由此证实，EHF 可直接抑制β-catenin 的转录。

图2 EHF 通过抑制β-catenin 的转录影响Wnt/β-catenin 通路的活性

2.4 利用XAV939 阻断Wnt/β-catenin 通路的活性

以上结果证实EHF 可抑制Wnt/β-catenin 通路的活性，为进一步证实Wnt/β-catenin 通路在EHF 促进干性过程中的重要性，本研究进行了阻断实验，借助XAV939 阻断Wnt/β-catenin 通路的活性。XAV939通过抑制聚ADP-核糖基化酶tankyrase 1 和tankyrase 2稳定axin，从而刺激β-catenin 发生降解进而阻断Wnt/β-catenin 通路的活性[13]，是效果确切的Wnt/βcatenin 通路抑制剂。在EHF 敲低后，Wnt/β-catenin 通路激活，在此基础上利用XAV939 抑制该通路的活性，随后通过Western blot 和RT-qPCR 实验进行验证。结果发现，在SW1990 细胞中，由EHF 敲低引起的Wnt/β-catenin 通路激活，经XAV939 处理后，βcatenin、c-myc 及CD44 的含量均出现明显的回落，差异均具有统计学意义（均P＜0.01，图3），但EHF 的含量并不受XAV939 的影响。且由于XAV939 仅影响β-catenin 的降解，故β-catenin 的mRNA 水平并不会受到XAV939 的影响。

图3 利用XAV939 阻断Wnt/β-catenin 通路的活性

2.5 阻断Wnt/β-catenin 通路可抑制由于EHF 敲低引起的干性上调

利用流式细胞术、悬浮成球及软琼脂克隆这3 种经典的干性功能学实验检测胰腺癌细胞的干性变化。研究显示[14]，选择ESA、CD24 和CD44 作为胰腺癌干性特征的标志物，三个指标均为阳性的细胞被认为是具有干性特征的胰腺癌细胞。如图4A 所示，在SW1990 细胞中，随着EHF 敲低，干性特征细胞增多（P＜0.01），但是经XAV939 处理后，具有干性特征的细胞比例明显减少（P＜0.01），甚至降至对照组水平（P＞0.05）。与流式细胞术结果相同，发现随着EHF 的含量下降，胰腺癌细胞的悬浮成球能力及软琼脂克隆形成增加（P＜0.001），但经XAV939 处理（2 μM）后，悬浮成球及软琼脂克隆的数量和大小均出现明显下降（P＜0.001，图4B，4C）。虽然EHF 作为转录因子可能会通过调控多条通路而抑制胰腺癌细胞的干性，但通过上述实验可以得出结论，Wnt/β-catenin 通路在其中占有主导作用。

图4 阻断Wnt/β-catenin 通路可有效抑制由EHF 敲低引起的胰腺癌细胞干性上调

3 讨论

胰腺癌是一种相对少见的消化道恶性肿瘤[15]，其发病率为十万分之十二到十五，位于胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌之后，位列消化道恶性肿瘤的第5 位[16]。由于其解剖位置相对隐匿，早期症状缺乏特异性，患者就诊时往往已处于晚期，可接受手术的患者比例不足20%，而可以从中获益的患者甚至不足5%[17]。胰腺癌可以选择的化疗药物非常有限[18]，且存在严重的耐药现象[19]，而分子靶向治疗[20]及免疫治疗[21]在胰腺癌中的响应均较差[22]，导致胰腺癌整体的死亡率几乎与发病率持平[23]。因此迫切需要寻找胰腺癌治疗的新靶点。

EHF 为本课题组重点关注的具有抑癌作用的转录因子，前期研究发现EHF 可抑制胰腺癌发生上皮间质转化，进而抑制胰腺癌的转移[2]。考虑到恶性肿瘤发生上皮间质转化与肿瘤细胞的干性特征息息相关[24]，干性又是引起恶性肿瘤耐药[25]和远处转移[26]的重要原因，而EHF 被证实可抑制胰腺癌细胞的干性[5]，故推测可以从EHF 入手寻找抑制胰腺癌细胞干性的方法。作为转录因子，EHF 调控的下游靶基因及信号通路众多。在精准治疗的背景下，可将影响权重最大的通路筛选出来，并针对其进行临床治疗的转化研究。因此，本课题组借助生物信息学的分析方法筛选出受EHF 调控且会影响肿瘤细胞干性的Wnt/β-catenin 通路，通过Western blot 和RT-qPCR 实验证实其调控关系，即在胰腺癌细胞中EHF 的表达水平与Wnt/βcatenin 通路的活性呈负相关。后续的机制实验也证实，EHF 可通过抑制β-catenin 的转录发挥下调Wnt/βcatenin 通路活性的作用。

为证实Wnt/β-catenin 通路在EHF 影响胰腺癌干性过程中发挥重要作用，本研究利用该通路的活性抑制剂XAV939 成功构建了阻断实验模型。以此模型为实验对象，应用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验等得出了一致的结论，虽然EHF可能调控很多分子信号通路，但Wnt/β-catenin 通路在其中占据主导地位，针对该通路进行抑制是有意义的。后续可以尝试利用Wnt/β-catenin 通路抑制剂来降低胰腺癌细胞的干性能力，进而减少远处转移，甚至逆转耐药，而EHF 也有望成为筛选从该治疗中获益人群的分子标记物。

本研究也存在不足之处。首先，仅在胰腺癌细胞系中进行了探索，后续仍需在动物体内甚至临床试验中验证实验结论的正确性和治疗的安全性。其次，XAV939 是否符合活体使用的标准，是否需要改变化学结构以适用于临床试验，亦或在已经上市的药物中是否已经存在抑制Wnt/β-catenin 通路活性的药物，这些均是接下来研究工作的重点。EHF 伴随诊断的检测方法及标准也存在很多不确定性，使用免疫组织化学法进行检测还是基因测序[27]，或者使用创伤性更小的技术如ctDNA 或ctRNA 的液态活检等[28]，需要更加深入的头对头研究去选择敏感性和特异性更高、临床操作简便、同时符合医学经济学要求的检测方法。

综上所述，EHF 可抑制胰腺癌细胞的干性，而Wnt/β-catenin 通路在该过程中起着主导作用，体外实验证实通过抑制该通路的活性可有效降低肿瘤细胞的干性。该研究为胰腺癌临床治疗提供了新的思路，但尚待进一步的体内研究进行论证。