六味能消制剂中土木香内酯和异土木香内酯含量测定研究及工艺探讨

焦兴苹 马青青 杨凤梅

青海省药品检验检测院/国家药品监督管理局中药(藏药)，青海 西宁 810016;质量控制重点实验室/青海省中藏药现代化研究重点实验室，青海 西宁 810016

六味能消制剂(六味能消丸、六味能消胶囊及六味能消片，以下同)是由藏木香、干姜、诃子、大黄、寒水石、碱花等六味药材制成的复方制剂[1]。主要功效为：助消化，消肿，理风和胃，用于食物中毒症、积食不化、胃疼痛、胸腹肿胀、大便干燥、难产、胞衣脱落难等症[2]。

藏木香味甘、苦、辛，藏医理论认为其可助消化，清风热、隆血热、培根热，治疗疫疠、胃脘疾病与培根赤巴症等[3]；中医认为其具有健脾和胃，行气止痛的功效，用于治疗胸肋、腕腹胀痛，呕吐泻痢，胸肋挫痛等症[4]。藏木香中土木香内酯和异土木香内酯具有多种药理活性[5-6]，如土木香内酯与异土木香内酯均有杀虫作用，分离纯化的异土木香内酯对四氯化碳致大鼠的肝损伤具有保护作用[7]。

藏木香在六味能消制剂的功能与主治中起关键作用，本研究采用气相色谱法对A、B、C、D 4个厂家生产的六味能消制剂中藏木香所含挥发性成分土木香内酯和异土木香内酯的总含量进行了测定，并制定合理限度，从而考察该制剂中藏木香是否规范投料以及各厂家生产工艺中温度参数是否合理。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Sartorius SQP电子天平(德国赛多利斯)；7890B型气相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；Milli-Q advantage A10超纯水系统(Merck millipore)。

1.2 试药 藏木香对照药材(中国食品药品鉴定研究院，批号：121630-201001)、土木香内酯对照品(中国食品药品鉴定研究院，批号：110760-201811；纯度：99.4%)、异土木香内酯对照品(中国食品药品鉴定研究院，批号：110761-201510；纯度：98.8%)中国食品药品鉴定研究院；甲醇(AR，西陇化工股份有限公司)。

1.3样品 六味能消丸(胶囊、片)共29批，涉及青海省、甘肃省、西藏自治区的4个生产厂家4种规格，该样品均为市售样品。详细信息见表1。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 土木香内酯和异土木香内酯总含量测定

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 混合对照品溶液 精密称取土木香内酯对照品10.83 mg、异土木香内酯对照品10.47 mg分别置25 mL具塞容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得土木香内酯(浓度：0.43060 mg·mL-1)、异土木香内酯(浓度：0.41377 mg·mL-1)对照品储备液。分别精密吸取各储备液1.5 mL置于50 mL具塞容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得(该混合对照品溶液含土木香内酯12.9180μg·mL-1，异土木香内酯为12.4131μg·mL-1)。

2.1.1.2 样品溶液 取六味能消丸(胶囊、片)粉末1.0 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理(220 V 35 kHZ)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.1.3 阴性样品溶液 参照六味能消胶囊处方，按比例称取除藏木香外其余各药材，制成缺藏木香阴性样品，并依照“2.1.1.3”方法制备，即得缺藏木香阴性对照溶液。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent HP-5毛细管柱(柱长30 m,内径0.32 mm)；进样口温度：260 ℃；分流比：5∶1；检测器(FID)温度：280 ℃；流量控制模式：恒流模式；氮气(载气)：40 mL·min-1；氢气：40 mL·min-1；空气：400 mL·min-1；流量：1.5 m·min-1；柱温：程序升温，初始温度为165 ℃，保持25 min，以90 ℃/min的速率升温至240 ℃，保持5 min。

2.1.3 系统适用性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、样品溶液与阴性样品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，按“2.1.2”项下色谱条件进行测定。结果显示，样品溶液色谱中在与土木香内酯、异土木香内酯混合对照品色谱峰相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，阴性样品溶液无干扰，各成分色谱图如图1所示。

1.土木香内酯；2.异土木香内酯图1 混合对照品溶液(A)、样品溶液(B)、阴性样品溶液(C)GC图

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 分别精密吸取土木香内酯(0.43060 mg ·mL-1)、异土木香内酯(0.41377 mg ·mL-1)的对照品储备液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、3 mL，分别混至5个50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混标溶液。分别精密吸取各系列浓度的标准溶液1μL，注入气相色谱仪，测定，以混合对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。得土木香内酯、异土木香内酯的回归方程分别为y=2.8704x+0.6924，相关系数r=0.9981，y=2.996x+0.4569，相关系数r=0.9991；土木香内酯、异土木香内酯进样量分别在4.31～25.83 μg·mL-1、4.14～24.83 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.2 精密度试验 精密吸取土木香内酯(12.9180 μg·mL-1)、异土木香内酯(12.4134 μg·mL-1)的混合对照品溶液1 μL，连续进样5次，测得土木香内酯、异土木香内酯峰面积RSD分别为0.79%、0.62%，结果表明土木香内酯、异土木香内酯精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 精密称取六味能消胶囊(企业C批号190701)粉末1.0 g，按“2.1.1.2”项下方法制备，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入气相色谱，记录峰面积，结果土木香内酯、异土木香内酯峰面积RSD分别为0.91%、1.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.4 重复性试验 精密称取六味能消胶囊(企业C批号190701)粉末1.0 g，共6份，按“2.1.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进行测定并计算含量，结果土木香内酯、异土木香内酯的总含量RSD为0.88%，表明方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验 取已知含量的六味能消胶囊(企业C 批号190701)粉末6份，每份约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入土木香内酯(3.8754 μg ·mL-1)、异土木香内酯(5.3790 μg·mL-1)的混合对照品溶液25 mL，按“2.1.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率。测得土木香内酯、异土木香内酯平均回收率分别为101.72%、102.85%，RSD分别为0.98%、1.51%。

2.3 样品测定 将4家企业29批不同批次的样品，照“2.1.1.2”方法制备成供试品溶液。按“2.1.2”项下色谱条件进行测定，根据藏木香在各剂型处方中的占比计算土木香内酯、异土木香内酯的总含量。结果见表2。其中丸剂共有15批，测定结果最大值为0.87 mg/g，最小值为0.06 mg/g，平均值为0.24 mg/g，中位值为0.11 mg/g；胶囊剂共有10批，测定结果最大值为1.07 mg/粒，最小值为0.17 mg/粒，平均值为0.38 mg/粒，中位值为0.25 mg/粒；片剂共有4批，测定结果最大值为1.08 mg/粒，最小值为0.69 mg/粒，平均值为0.94 mg/粒，中位值为1.00 mg/粒。

表2 土木香内酯、异土木香内酯总含量测定结果 (n=2)

3 结果分析及讨论

3.1 结果分析 测定结果表明，六味能消制剂不同生产企业间、相同生产企业不同批次间土木香内酯、异土木香内酯总含量均存在一定差异(利用SPSS软件绘图，如图2所示)。藏木香属于挥发性药材，其中含有萜类挥发性成分较多，这些成分对温度较为敏感，含量受原料质量、储藏、生产工艺的影响较大，企业C、企业D生产工艺各流程温度均控制在较低水平，并且加热时间短，土木香内酯和异土木香内酯含量结果均在较高水平；企业A、企业B生产工艺中投料原药材灭菌温度高于100 ℃，并且加热时较长，导致土木香内酯和异土木香内酯的转移率进一步下降，造成含量结果均处于较低水平。

图2 六味能消制剂各生产企业土木香内酯、异土木香内酯总含量箱式图

3.2 色谱条件考察 笔者参考《中国药典》2020年版一部中土木香项下含量测定方法及相关文献，考察了甲醇、乙酸乙酯等溶剂的提取效果，结果显示甲醇提取率较其他溶剂高，因此采用甲醇作为提取溶剂[8]。分别采用DB-5，DB-17，HP-5色谱柱考察分离效果，结果HP-5毛细管柱分离效果好，溶剂峰影响较小，故本实验采用HP-5色谱柱。

3.3 讨论 目前六味能消制剂标准不统一，仅有六味能消胶囊具藏木香的定性考察。定量控制手段的缺乏，使得各标准无法客观反映藏木香药材的整体质量，造成部分企业或为追求利润以次充好、或工艺条件设置不合理等情况，导致了六味能消制剂中土木香内酯、异土木香内酯含量较低，影响了六味能消制剂的质量和疗效。本文建立了GC法测定土木香内酯、异土木香内酯含量，该测定方法操作简单，结果准确，可以用于考察六味能消制剂的质量，为完善六味能消制剂标准和设置工艺参数提供依据。同时建议企业生产企业加强挥发性药材的原料管理和控制，优化生产工艺，完善和提高民族药质量标准研究，促进民族药的快速发展。