肌萎缩侧索硬化诊断标志物的研究进展

周益毅 徐仁伵

(1南昌大学第一附属医院神经内科，江西 南昌 330006；2江西省人民医院神经内科)

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种同时累及上、下运动神经元的致死性神经系统退行性疾病。由于ALS疾病起病隐匿，早期临床表现缺乏特异性，且目前为止尚缺乏特异性诊断标志物，从而导致该病的早期诊断困难。有国外报道显示ALS患者的平均诊断延迟时间为8～14个月，因此，各国学者一直致力于寻找各种有价值的诊断标志物，以助于ALS患者的早期诊断及评估疾病的进展和预后。本文对ALS诊断标志物的研究进展进行综述。

1 基因诊断标志物

5%～10%的ALS患者具有家族遗传性，称为家族型ALS(FALS)，其余90%～95%为散发型ALS(SALS)。其中FALS通常为常染色体显性遗传，其遗传方式遵循典型的孟德尔遗传定律，少数为常染色体隐形遗传或X染色体遗传。自从1993年SOD-1基因(编码超氧化物歧化酶1)作为首个被发现的ALS致病基因以来，已相继发现了30余个FALS致病基因。其中编码超氧化物歧化酶(SOD)-1、编码泛素样蛋白(UBQLN2)、编码C9orf72蛋白等致病性主要是由于基因突变导致其编码的蛋白失去原有构型或发生错误折叠，导致蛋白功能异常或形成异常聚集物。肉瘤融合蛋白基因(FUS)、Senataxin(SETX)基因、血管生成素基因(ANG)、TAR DNA-结合蛋白基因(TDP-43)、异构核糖核蛋白A1基因(hnRNPA1)、基质蛋白3基因(MATR3)等主要通过影响DNA的损伤修复及RNA的代谢过程导致ALS发病。Alsin基因、遗传性痉挛性截瘫11型(SPG11)基因、缬络胺酸蛋白基因(VCP)、SQSTM1基因的突变则主要影响自嗜-溶酶体功能，出现神经元内稳态异常，进而导致神经退行性疾病发生。CHCHD10基因突变可导致线粒体DNA稳定性异常，影响线粒体的复制和功能稳定性，也被认为是ALS可能的致病基因之一〔1〕。在ALS致病基因中，SOD1基因突变约占FALS病例的20%，SALS病例的5%；TDP-43和FUS约占FALS基因突变的5%；ANG约占FALS的1%；其他突变基因较为少见〔2〕。虽然明确的基因突变占全部ALS的比例相对较少，但对于突变基因的研究有利于人们进一步了解ALS的病理过程并探究可能的发病机制和治疗方法。随着全基因组关联研究(GWAS)和二代测序(NGS)的广泛应用，将会有越来越多的致病基因被发现，而这些基因标志物将有助于ALS的早期诊断。

2 体液诊断标志物

ALS的体液诊断标志最常来源于脑脊液和血液。由于脑脊液与中枢神经系统直接接触，通过检测脑脊液中的生物标志物可直接反映中枢神经系统损伤情况。而且脑脊液独立于机体的其他系统，受干扰因素较血液等其他组织标本少，因此脑脊液中的ALS相关标志物具有更高的特异性，且多与疾病进展相关。而血液为基础的标志物则可能来自透过血脑屏障的颅内标志物，也可能来源于身体其他器官在ALS病理反应下产生的特异性标志物。由于血液的获取较脑脊液更加便捷，因此从血液中寻找具有诊断意义的ALS标志物也成为一个重要研究方向。

2.1神经丝蛋白 神经丝蛋白是目前作为研究ALS症和其他神经疾病的理想生物标志物之一。神经丝蛋白是细胞骨架结构蛋白，当轴突损伤时可进入脑脊液和血液，由于其稳定性较好，易于通过免疫方法进行检测。多项研究表明，在ALS患者脑脊液中磷酸化神经丝重链(pNFH)不仅具有诊断价值，还可用于评估疾病进展及生存率〔3〕。Weydt等〔4〕检测了有症状和无症状ALS相关基因C9orf72携带者的脑脊液pNFH和神经丝轻链(NFL)水平，发现有症状的突变携带者中检测到pNFH和NFL水平升高，但在无症状的ALS突变携带者中均未检测到pNFH和NFL水平升高。而这与携带C9orf72重复扩增者的ALS发病率相一致。因此认为NFL可作为只在ALS患者出现或即将出现症状时才会显著增加的标志物。

2.2SOD1 SOD1是一种广泛表达的抗氧化酶，参与过氧化物转化为氧和过氧化氢，保护细胞免受氧化应激。近20%的FALS病例是由SOD1基因突变引起的，并已被广泛研究证实。有研究检测了ALS患者和对照组之间的脑脊液SOD1水平，但未能发现两组之间的显著差异，表明SOD1 脑脊液水平并不能作为ALS的诊断性标志物。但有研究表明，SOD1虽然不是一种诊断性生物标志物，但可作为一种诱导SOD1降低的治疗方法的药效学(PD)生物标志物〔5〕。

2.3C9orf72 C9orf72重复扩增可在包括FALS和额颞叶痴呆(FTLD)等多种神经退行性疾病中检测到。在ALS和FTLD患者中可检测到由C9orf72重复扩增翻译来的5个二肽重复蛋白(DPRs)，且该蛋白已被证实具有诱导神经毒性作用〔6〕。研究还发现DPRs可诱导产生应激颗粒，能限制翻译起始，是ALS的特征性病理改变之一〔7〕。因此通过检测C9orf72重复扩增或血和脑脊液中DPRs可作为诊断ALS的重要生物标志物。

2.4TDP-43 TDP-43已被大量研究证实广泛存在于SALS和FALS的胞质内。TDP-43也是目前被认为是最有价值的ALS生物标志物之一。但由于TDP-43在体液中可能存在产生限制免疫检测的抗体结构〔8〕，导致目前仍难以作为一种有效的生物标志物用于临床检测。

2.5胱抑素(Cystatin)C Cystatin C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，参与细胞外基质(ECM)调控，在ALS背景下，Cystatin C已被确定为一种嗜酸性包涵体——bunina小体的组成部分，而在中枢神经系统中Cystatin C水平的降低也与TDP-43包涵体的形成有关。在一项ALS的纵向研究中，脑脊液中Cystatin C水平随着时间的推移，快进展和慢进展组的Cystatin C水平分别呈现下降和升高的趋势〔9〕。而ALS患者血浆中Cystatin C水平却明显升高。因此，将Cystatin C作为ALS的生物标志物仍有待进一步研究。

2.6miRNA miRNA通过切割或翻译抑制来调节基因表达过程，miRNA调控的改变与多种中枢神经系统疾病有关。研究表明在ALS患者脊髓中和携带有ALS相关突变基因的脊髓运动神经元中miRNA表达减少，miRNA-1234-3p在SALS患者血清中较健康对照组显著下降，而在FALS患者血清中与健康对照组无显著差异〔10〕。提示miRNA-1234-3p可用于SALS的特异性诊断。血浆miRNA-4649-5p在SALS患者中升高，并与病程呈负相关〔11〕。miRNA424和miRNA-206在ALS血浆中的表达明显高于健康对照组。提示miRNA可能成为一种ALS的潜在的生物标志物。

2.7谷氨酸 谷氨酸兴奋性毒性作用是目前公认的运动神经元死亡的病理机制之一，且研究证实在ALS患者脑脊液中存在较高水平的谷氨酸盐〔12〕。Wuolikainen等〔13〕对SOD1基因突变的ALS患者的脑脊液进行基于质谱的代谢组学研究，发现主要诊断标志物的代谢产物包括精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、苏氨酸和焦谷氨酸。而在最近的研究中还发现ALS患者脑脊液和血浆中肌酸水平明显升高〔14〕，提示肌酸代谢异常可能与ALS的发病相关。而在对ALS患者血浆中氨基酸浓度筛选中发现谷氨酸和赖氨酸水平升高，而亮氨酸水平降低，其中谷氨酸水平的升高与病程呈正相关，提示谷氨酸盐可能作为评估疾病进程的重要代谢标志物。

2.8炎症介质 通过脑脊液蛋白组学分析研究发现ALS脑脊液中炎症反应过程主要包括急性炎症反应和补体激活。如乳酸脱氢酶活性增加提示神经退行性变；几丁质酶(Chit)-1表达增加提示小胶质细胞激活；血清干扰素水平与疾病进展相关；白细胞介素(IL)-6水平与缺氧严重程度相关〔15〕。而在ALS患者血液中发现肌酸激酶、铁蛋白、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12P70、IL-4、IL-5、IL-10、IL-1明显升高，而γ干扰素(IFN-γ)明显下降〔16〕。除了炎症因子，抗炎因子水平转化生长因子(TGF)-β1证明与ALS疾病持续时间呈正相关〔17〕。因此各种炎症介质也成为ALS的潜在标志物。

2.9其他 除了以上常见的ALS的生物标志物，有研究通过检测尿液发现神经营养素受体p75(p75NTR)、葡萄糖半乳糖基羟基赖氨酸(Glu-Gal Hyl)、Ⅳ型胶原蛋白和8-羟基-2′脱氧鸟苷(8OH2′dG)也被认为是ALS可能的生物标志物，值得进一步研究。而在ALS患者唾液中发现嗜铬粒蛋白(Chromogranin)A较对照组升高，皮质醇(Cortisol)较正常降低，也被认为是可进一步研究的候选生物标志物。

3 神经肌肉超声

神经肌肉超声因其具有无创性、便携性、直观性等特点，近年来在ALS的早期诊断、疾病进展评估及观察治疗效果方面得到了越来越广泛的应用。由于其可对中枢神经系统、周围神经系统、肌肉系统的结构和功能进行连续的动态评估，弥补了传统神经电生理检查的不足〔18〕。

肌肉超声(MUS)是ALS患者中应用最广泛的超声检查方法。该技术主要通过检查多个神经节段的肌束颤动、肌肉萎缩和结构变化来筛查与ALS诊断相关的疾病。Misawa等〔19〕研究发现MUS比传统的肌电图(EMG)检查对肌束颤动的检测敏感性更高，识别率从88%提高到98%。而且MUS为包括颅肌在内的亚临床区域的下运动神经元功能障碍提供了一种灵敏、可重复的筛查工具。Tamburrini等〔20〕发现通过视频超声(VUS) 可对吞咽过程的口腔期进行形态和结构的动态观察、Nakamori等〔21〕专门研究了ALS患者舌肌厚度的超声测量；这些都可作为提示球部肌肉上运动神经元损害的标志。MUS还可显示肢体肌肉结构的形态学变化，特别是通过测量肌肉回声强度(EI)、回声变化(EV)和灰度共生矩阵(GLCM)的变化，可以评估疾病的进展程度〔22〕。Arts等〔23〕证明了MUS在区分ALS和模拟疾病中的诊断价值，其敏感性为96%，特异性为84%。

神经超声(NUS)可通过测量周围神经的横截面积(CSA)和颈神经根丛直径反映下运动神经元损伤导致的神经萎缩〔24〕。但在目前的研究中，尚无法明确周围神经或神经根CSA与ALS患者临床严重程度、疾病病程或电生理检查指标间的关系。

虽然神经肌肉超声在ALS的诊断上具有一定的可行性及优势，但由于受到机器性能、操作者的熟练程度及目前的研究结果影响，神经肌肉超声检查目前仅作为传统电生理等检查的一种补充。但随着对ALS患者神经肌肉超声研究的进一步深入，越来越多ALS特异性神经肌肉超声标志物的发现，其在ALS的诊断中所起的作用也将增大。

4 神经电生理

神经电生理检查主要包括神经传导测定和针肌电图检查，是目前ALS诊断必不可少的检查之一。神经电生理检查可提供支持ALS诊断的证据，从而提高诊断的阳性率，缩短诊断延迟时间〔25，26〕。

4.1神经传导检测 神经传导检测主要包括运动神经传导检测、感觉神经传导检测和F波检测。其中运动神经传导检测主要包括运动神经传导速度(MCV)、运动神经远端潜伏期(DML) 和复合肌肉动作电位波幅(CMAP)。在ALS患者中由于存在肌肉萎缩，常出现CMAP波幅降低或消失。而作为ALS运动神经传导检查的特征性表现之一的“分裂手”现象是由于在ALS中可出现拇短展肌和第一骨间肌较小指展肌更早出现肌无力及萎缩，且程度更重，进而在神经传导检查中表现为拇短展肌与小指展肌 CMAP 波幅比<0.6 或第一骨间肌与小指展肌 CMAP 波幅比<0.9，其对 ALS 的早期诊断及鉴别诊断具有重要意义〔27〕。Simon等〔28〕研究发现ALS患者下肢也存在腓总神经CMAP波幅低于胫后神经的现象，被称为“分裂脚”现象。Pinto等〔29〕研究发现胸锁乳突肌的CMAP波幅降低程度可能是评估ALS患者呼吸功能的一个重要指标。传统观念认为ALS仅累计运动神经元，而感觉神经通常不受累。而越来越多的研究证实ALS患者可出现感觉异常，并通过检查证实感觉神经动作电位潜伏期延长，波幅下降和传导速度减慢均可出现在ALS患者中，还发现在ALS患者中存在显著的F波的异常，主要表现为F波的振幅增加和持续时间缩短，而这一现象不仅出现在ALS进展期，也可出现在其他任何时期的ALS患者中〔30〕。除了以上传统神经电生理标志物，神经生理指数(NI)、运动单位数评估(MUNE)也越来越多的用于ALS的诊断和评估下运动神经元损害的严重程度。NI=(CMAP 波幅/远端运动潜伏期)×F波的频率，该值的意义在于将神经、肌肉系统作为一个整体对下运动神经元损害进行评估，相较其他指标灵敏度及特异性都更高〔31〕。MUNE是计算神经内全部运动单元的总和，即最大CMAP，然后除以代表该神经中单个运动单元的平均值，从而提供运动单元数的估计值。最近，一种新的MUNE方法MScanFIT MUNE被提出，使用详细的刺激-响应曲线，或CMAP扫描，提供有关所有运动单元CMAP的信息，与其他MUNE方法相比，具有更好的重复性、运动单元丢失检测和疾病进展等优点。一项为期15个月的纵向多中心研究强调了运动单元指数(MUNIX)〔32〕作为ALS疾病进展的预测因子具有较好的敏感性和可靠性，并表明MUNIX与各种MUNE技术之间存在显著的相关性。

4.2针电肌电图 针电肌电图是鉴别ALS下运动神经元损害的重要检查之一，它可在患者出现下运动神经元损害临床表现或阳性体征前对其进行鉴别，从而为ALS的早期诊断提供支持证据。ALS患者在针电肌电图检查中发现正锐波、纤颤电位及束颤电位(FPs) 可提示存在活动期神经源性损害；发现运动单位电位时限增宽、波幅升高及多相波增多可提示慢性神经源性损害。近年来，随着对FPs的研究深入，发现ALS相关的FPs存在波形不稳定、发放频率慢的特点，与健康人偶尔可测得的形态单一、时限短、波幅小，波形稳定的良性FPs有显著差异。FPs对于ALS的诊断上与正锐波、纤颤电位具有同等重要的价值。因此有研究也纳入了FPs作为ALS的神经电生理的标志物。需要注意的是，在该研究的诊断标准中提出，针电肌电图检测必须在4个解剖区域(延髓、颈随、胸髓和腰髓)中分别检测不同神经根及不同周围神经支配的两块或以上肌肉，以明确是否具有广泛的下运动神经元损害，进而在提高ALS诊断的灵敏度的同时提高诊断特异度〔33〕。

4.3电阻抗肌电图(EIM) EIM是在检测肌肉上放置一组4条电极，在2条外部电极之间施加一定高频电流，在2条内部电极间检测随之产生的表面电压。所测得的表面电压反映了下层组织的导电和电容特性。这种方法不是产生肌肉纤维兴奋，而是提供深部组织的电形态学数据。在对SOD1小鼠的研究表明〔34〕，EIM对疾病进展具有较强的敏感性和高可靠性。同时该技术操作简便、无创，可对全身大多数浅表肌肉进行检测。但由于其并非检测肌肉自发电位，因此常需与针极肌电图联合检测用于ALS的诊断中。

4.4重复电刺激(RNS) RNS检查是通过低频或高频重复刺激神经干后评估神经肌肉接头功能的一项检查，常被用于重症肌无力的诊断。ALS患者也常出现类似于重症肌无力的RNS出现频率递减的现象，其机制可能是由于ALS中下运动神经元损害导致的轴突退化所致。而在颈椎病中RNS多为正常，因此该指标可用于ALS的鉴别诊断。

4.5经颅磁刺激(TMS) TMS是一种通过高强度的交变磁场穿透颅骨进而改变大脑局部皮质兴奋性，以评估上运动神经元的功能的一种非创伤性刺激技术。运动阈值(MT)是指能诱发靶肌肉产生动作电位的最小TMS的强度，而研究发现在ALS患者双侧大脑皮层的MT显著增加，提示皮层运动神经元的减少导致皮层兴奋性下降，是上运动神经元损害的直接标志〔35〕。而且有研究发现MT值与总肌萎缩侧索硬化功能评分量表(ALS FRS)评分及肌萎缩侧索硬化中医疗效评价量表(ALS-SSIT)评分呈负相关，即MT值越高，疾病越严重。因此MT值还可作为评估ALS病情进展及严重程度的重要标志物〔36〕。中枢运动传导时间(CMCT)和皮层刺激静息期(CSP) 在诊断上运动神经元损伤方面也具有较高的敏感性和特异性，在ALS中常表现为CMCT的延长和CSP持续时间的减少或缺失。并且可通过增加检查肌肉的部位和数量进一步提高CMCT和CSP诊断敏感性和特异性。通过将TMS和功能磁共振成像(MRI)检查相结合可更全面地评估皮层上运动神经元的功能和损害程度，在ALS的早期诊断和评估中起到越来越重要的作用。

5 神经影像

在ALS病程中随着神经元的退化，中枢神经系统经历了巨大的结构变化和细胞水平的变化，而在传统神经影像中这种变化是难以发现的。随着多种功能MRI的发展，使得各种分子和细胞层面的中枢神经系统异常可通过影像的方式直观呈现出来。不仅有助于ALS的早期诊断，还能更好的呈现ALS的病理生理进程。 5.1质子磁共振波谱(H-MRS) 是通过检测组织中的N-乙酰天冬氨酸(NAA)、胆碱(Cho)、肌酸(Cr)等代谢物浓度，反应神经组织的生化代谢情况，进而发现可能的病理损害的方法。翦凡等〔37〕通过对31例散发型ALS的H-MRS检测发现ALS患者中央前回皮质下、内囊后肢、大脑脚等沿锥体束走行部位的NAA/Cr和NAA/(Cho+Cr) 较对照组显著降低，提示该区域神经代谢异常。可作为评估上运动神经元的客观影像标志物。但由于该指标曲下线面积(AUC)为0.67～0.9，其辅助诊断ALS的准确性中等，如需临床推广应用仍有待进一步研究。

5.1弥散张量成像(DTI) DTI是通过检测水扩散局部方向性的差异来评估组织结构的MRI检查技术。而由于大脑白质纤维束中的水分子与其他脑组织中的自由水分子存在弥散率差异，通过图像处理技术后可显示大脑白质纤维的结构和各向异性特征。Chapman等〔38〕研究发现与正常对照组相比，ALS患者DTI检测可发现广泛的白质病变，而这些病变与ALS的上运动神经元损害程度呈正相关。进一步DTI研究发现在ALS患者中还存在皮质脊髓束、胼胝体和内囊的后肢、小脑和颞顶叶等诸多局灶性异常改变〔39〕。提示DTI可能是一种潜在的反映ALS疾病进展的标志物。

5.2功能MRI(fMRI) fMRI是通过检测血流与血氧的改变反映受外界刺激时活化的脑组织区域。ALS患者的皮层重组已被证实，表现为在运动任务期间，对侧和同侧运动区(包括感觉运动皮层、补充运动区、基底节区和小脑)的激活增加〔40〕。而对侧运动区的过度激活可能与疾病进展相关。纵向研究表明，ALS早期由于感觉运动皮质内抑制的丧失导致皮层激活增加，而在疾病中晚期由于运动神经元退化导致皮层激活减少〔41〕。但fMRI作为一种评估ALS病情严重程度的标志物仍有待进一步大量纵向研究提供证据支持。

综上，越来越多的致病基因的发现进一步证实ALS是一种病因复杂累计多系统的神经系统退行性疾病。因此，不可能通过某一种单一诊断标志物对全部ALS进行诊断也逐渐成为一种广泛的共识。而包括基因检测、致病蛋白、神经电生理、神经影像等多方面的诊断标志物成为目前ALS诊断的主要研究方向。随着对ALS疾病病理过程的深入研究，进一步发现更多不仅有助有疾病早期诊断，同时对病情发展、严重程度、治疗疗效判定都相关性的ALS标志物将成为今后研究的重点。