金银花与山银花现代鉴别方法研究概况

伍 婷 杜家会 李振斌 姚天月 李茂凯 崔玉发

黔西南民族职业技术学院，贵州 兴义 562400

金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，主产于河南、山东等北方省份。药理研究[1]表明金银花具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、抗生育、抗氧化、保肝利胆等多种药理作用。含有金银花的中成药连花清瘟胶囊、金花清感颗粒在新冠肺炎治疗中发挥积极效果。Zhou Likun等[2]研究发现金银花汤剂中的植物MIR2911能够抑制SARS-CoV-2的复制，加速新冠感染患者的痊愈。

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、红腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、华南忍冬LoniceraconfusaDC.或黄褐毛忍冬Lonicerafulvoto-mentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花，主要产于湖南、四川、贵州、云南等南方省份。金银花与山银花均来源于忍冬科植物，二者在外观性状等方面有一定的相似性，2020版《中国药典》记载二者均具有清热解毒、疏散风热的功能，主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等疾病[3]。在价格方面山银花明显比金银花低，许多商家为获取更大经济利益，常在金银花药材及药物制剂投料中掺伪山银花。通过查阅文献发现二者在化学成分与含量存在显著差异，化学成分的不同将会影响金银花与山银花在药效上存在偏重。山银花中的绿原酸含量远高于金银花[4-6]，抗菌、抗炎、抗氧化、利胆等药理作用均与绿原酸有关[7]。研究[8-9]表明，金银花中绿原酸等酚酸成分含量越高，抗氧化活性越好。木犀草苷是金银花的标志性活性成分之一，具有较强的抗菌、抗病毒和保肝等作用，而山银花中的木犀草苷含量却很低甚至几乎检测不出[10-11]，2020版《中国药典》规定金银花(忍冬)中木犀草苷含量不少于0.050%，而对于山银花未做要求[3]。三萜皂苷类成分山银花比金银花多，Chai等[12]发现灰毡毛皂苷乙和川续断皂苷乙在山银花中含量较高，而金银花中未检测到这两种皂苷成分，若中药注射制剂中存在大量皂苷成分，很可能引起溶血等安全隐患[13]。此外，李文沛等[14]用金银花和山银花水提物进行小鼠体内过敏试验，发现山银花水提物会引起小鼠过敏反应，而金银花并未出现过敏反应；金银花和山银花均具有解热抗炎作用，且作用相当，但金银花的解热抗炎作用时间相对较长[15]。因此，在临床用药过程中，必须关注金银花与山银花内在化学成分的差异和药理作用的不同，并加以鉴别金银花与山银花，使药物对症治疗疾病，减少药害事件的发生，保护公众用药的安全性。

金银花和山银花为近缘植物，而药材在外观性状和显微特征上具有一定差异，这对于金银花与山银花的鉴别具有重要意义[16]。但在实际中药生产过程更多是将中药材制成粉末、提取物或制剂，经典的鉴别方法很难区分投料的药材来源，为避免金银花与山银花盲目混用，保证用药的安全、稳定、确切、可控，新的鉴定方法尤为重要。本文将从现代鉴别方法方面对金银花与山银花的鉴别进行概述。

1 薄层色谱(TLC)法

薄层色谱法是利用不同化合物在同一固定相中吸附能力不同，在移动相作用下，化合物在固定相中存在连续吸附、解吸附、再吸附、再解吸附过程而实现分离，可用于混合物的分离、鉴别和定量分析，检测方法简单、快速、高效。2020版《中国药典》关于金银花和山银花的理化鉴别中均以绿原酸为对照品采用薄层色谱法进行鉴别[3]，金银花和山银花均含有绿原酸，而山银花中含量较高，可根据薄层板上斑点大小鉴别二者，但该方法缺乏专属性。高珊等[17]采用薄层色谱方法，以分灰毡毛忍冬皂苷乙为对照品，鉴别金银花和山银花，结果发现可在山银花中检测出灰毡毛忍冬皂苷乙，而金银花中未检测出该物质，因此可根据薄层色谱中是否检测出灰毡毛忍冬皂苷乙来鉴别金银花和山银花。王立伟等[18]研究发现在薄层色谱上山银花的主斑点为灰毡毛忍冬皂苷乙，而金银花中灰毡毛忍冬皂苷乙斑点，并发现山银花掺伪量达到2% 时即可检测出灰毡毛忍冬皂苷乙斑点，该方法可用于检测金银花药物制剂是否掺伪山银花药材。陆顺瑶等[19]采用金银花对照提取物直接对比金银花和与山银花的异同点的方法，通过建立薄层色谱指纹图谱法鉴别二者，发现金银花提取物与不同产地的金银花药材的薄层图谱整体上基本一致，而山银花药材与金银花提取物相比薄层色谱差异较大，除此之外，还发现金银花中断马钱子酸斑点明亮，而山银花中几乎无此斑点，因此可通过对比薄层指纹图或是否有马钱子酸斑点从而高效、准确地鉴别金银花与山银花。

2 高效液相色谱(HPLC)法

高效液相色谱法是现代成分分析检测的重要手段之一，具有高效、高灵敏度、高选择性等特点。中药材及其制剂多以整体性产生协同作用达到治疗疾病的效果，分析单一成分来评价中药的质量及其药效极为不全面，HPLC指纹图谱对于研究中药质量控制和化学成分整体性研究尤为重要，是指纹图谱研究应用最广泛的手段之一[20]。熊艳等[21]建立金银花与山银花HPLC指纹图谱进行对比研究，发现金银花图谱相较为相似，而山银花相似度较低，另外对比研究二者的化学成分，发现成分和含量均存在显著差异，山银花中绿原酸含量明显高于金银花，山银花中几乎检测不出木犀草苷和芦丁，这三种物质可作为指标物质鉴别金银花与山银花。林永强等[22]建立了高校液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)对金银花和山银花进行定性鉴别，发现不同批次的山银花及提取物和制剂中均可检测出灰毡毛忍冬皂苷乙，而金银花及提取物和制剂中均未检出，表明灰毡毛忍冬皂苷乙可作为区别金银花与山银花的特征成分，且在药物提取和制备成产过程该成分较为稳定，对于制剂药源检测具有重要意义。刘亚楠等[23]在检测波长350nm条件下分别建立了金银花与山银花HPLC指纹图谱，并通过屏蔽峰面积占比较大的绿原酸和异绿原酸情况下，分别计算二者指纹图谱相似性，发现不同批次金银花HPLC色谱图相似度均在0.95以上，而山银花相似度低于0.8，与金银花指纹图谱差异较大，扣除大峰面积计算方式能全面而准确地反应出金银花与山银花与化学成分之间的细微差异，更有利于鉴别金银花与山银花。以往采用HPLC法鉴别金银花与山银花一般检测时间较长，且耗费溶剂较多。王浩冰等[24]采用UHPLC测定20批次不同的金银花与山银花中化学成分差异，结果显示灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙可作为山银花的特征成分，而金银花中均未检测出这两种成分，且该分析方法仅需8 min即可快速鉴别金银花与山银花。

3 核磁共振氢谱(1H-NMR)法

核磁共振氢谱是将化合物中1H核磁共振效应体现于核磁共振波谱法中，不同的化合物具有不同的氢谱特征，是鉴定有机化合物结构的强有力手段之一，同时还可根据图谱中信号相对强弱来反映各个组分的含量。每种中药都有特征的化学成分，这些特征成分的相对含量比例基本固定，从使得每种药材的1H-NMR指纹图谱具有特征性，犹如人的指纹与药材品种存在严格的对应关系[25]，且1H-NMR指纹图谱鉴别法操作简单、测试时间短、不损坏样品。卢凤来等[26]采用1H-NMR指纹图谱对金银花与山银花两种中药材的化学成分进行表征，发现不同产地金银花与山银花样品的1H-NMR指纹图谱各自具有较好的一致性，但两者的化学成分组成和含量均有显著差异，主要体现在高场区(δ 0.5～3.0)山银花信号明显强于金银花，而在δ 3.0～5.5区域金银花信号强于山银花，两者1H-NMR指纹图这一显著差异为金银花与山银花的鉴别提供可靠保证。

4 红外光谱法

红外光谱是分子中的基团选择性吸收某频率的红外线，通过检测红外线被吸收的情况可得到化合物的红外吸收光谱，不同的化学键或官能团吸收频率不同，呈现不同的吸收峰型和吸收位置，从而判断化合物可能存在的化学键及官能团类型。由于红外光谱分析法操作简单、灵敏度高、专属性强，且无需对样品做过多处理，又能较为全面反应样品化学成分信息，符合中药整体用药的思想，在中药材分析与鉴定中发挥着重要作用[27-29]。刘燕等[30]采用傅立叶变换红外光谱法检测金银花与山银花的挥发油，并对基线趋势去除和曲线平滑处理去除基线变化和噪音造成的干扰，发现在1800～850 cm-1范围内光谱数据特征性较强，对该波段进行聚类分析，结果显示金银花样品聚为一类，非金银花样品聚为另一类，表明该方法可将金银花与山银花区分开，在实际生产中可将金银花与山银花样品测定结果建立数据库，将待测样品与数据库数据进行聚类分析，若待测样品与数据库金银花数据聚类则为正品。刘征辉等[31]采用近红外光谱技术鉴别金银花与山银花，通过对近红外光谱5300～5550 cm-1、6900～7500 cm-1、8200～12000 cm-1波段处进行标准化处理，在主成分分析的聚类基础上采用多元变量统计分析软件模式分别建立金银花与山银花类模型，发现模型图中金银花样本集中性高，山银花样品集中性较低，能很好地识别金银花与山银花，为金银花与山银花的鉴别提供了新的方法和思路。邹婧等[32]通过采用傅立叶变换红外光谱结合二阶导数光谱法鉴别金银花与山银花，结果显示不同产地不同批次的金银花红外光谱基本相似，但与山银花相比具有明显差异，首先在原始红外光谱1800～1000 cm-1范围内山银花的吸收峰比金银花多且强；其次二阶导数红外光谱也有一定差异，主要表现为在1528 cm-1、1443 cm-1处山银花的吸收比金银花强，而在1670 cm-1、1426 cm-1、1190 cm-1处金银花吸收强度高，山银花几乎无明显吸收。

5 高光谱成像技术法

高光谱成像技术是指将成像技术与光谱技术融合在一起的一种检测方法，可同时获取研究样本内、外部品质特征的光谱信息和空间信息，检测快速、准确、无损，被广泛应用于农产品、药品的真伪鉴别与品质评价[33-36]。冯洁等[37]利用高光谱成像技术，对光谱经标准正态变量变换(SNV)预处理，应用连续投影算法(SPA)提取特征波长并建立最小二乘支持向量机(LS-SVM)判别分析模型作为金银花与山银花最优判别模型，所建模型对金银花与山银花的识别率高达100%，解决了常规性状鉴别识别度不高、主观性强及理化检验繁琐等缺点。

6 小结与展望

本文主要概述了金银花与山银花现代鉴别方法的研究进展。现代分析检测手段的迅猛发展丰富了金银花与山银花的鉴别方法，打破了经典鉴别识别度不高、主观性强等局限性，为金银花与山银花的药材粉末、提取物和制剂的鉴别提供了更多有效的检测手段，为金银花与山银花药材的规范应用提供科学依据。以期将金银花与山银花的分析鉴别方法推广到其他中药材和农产品的掺伪鉴定中，促进中药材产业的健康发展。