多元统计方法初步分析陕西产艾叶中挥发性成分特征

王春柳 万兆新 周 洁 安玉叶 龙凯花 刘 洋 张 红 李 晔 苏同生

(1 陕西省中医药研究院，西安，710003；2 陕西省中医医院，西安，710003；3 陕西中医药大学，咸阳，712046)

艾草，又称艾、艾叶、冰台、艾蒿、医草、灸草，是一种集药品、食品、保健品和文化特征于一体的药用植物[1-2]。最早关于艾的记载源于《诗经》中“彼采艾兮，一日不见，如三岁兮”[3]。两千多年来，艾草一直以各种身份出现在我国人民的生活中，不仅具有传统医用用途，在日用品、食品、保健品中也有大量应用，市场潜力巨大。不断增长的市场需求也对艾条和艾叶的产量及质量控制提出了更高的要求，但目前我国艾草产业发展还处于极不平衡的状态，品牌知名度较高的湖北蕲春和河南南阳区域艾草供不应求[4-5]，全国大面积艾草种植和规模化种植分布严重不均，难以满足全国骤增的市场需求。此外，艾叶及药用艾条的质量控制目前还不完善，制约了艾草行业整体的发展水平。陕西是艾叶的众多产区之一，本草学考证可归于古代“北艾”产区范围内[1，6]，在地理环境方面，陕西境内覆盖了艾草最适宜生长的北纬33°～36°范围[7]，非常适宜艾草生长。因此，在艾叶市场及陕西艾叶产业快速发展的推动下，积极开展艾叶的现代研究对于艾叶的质量控制具有重大意义。本文基于气相色谱-质谱(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS)联用技术，对陕西代表性产区的艾叶样本进行了挥发性成分鉴定及多元统计分析，为陕西产艾叶的科学质量控制方法的建立及物质基础研究提供部分参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 手提式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司，型号：DFT-200A)；万分之一分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：Sartorius BP61]；超声波清洗机[小美超声仪器(昆山)有限公司，型号：XM-P22H]；气相色谱质谱联用仪[岛津(上海)实验器材有限公司，型号：QP2010 Plus]。

1.2 试剂 实验用水为双蒸水。

1.3 分析样品 艾叶样品来自各产区样本分别于端午前1周采集，阴干后在密闭、25 ℃恒温保存约1个月后统一分析。所有样本经陕西省中医药研究院中药研究所党秋萍副研究员鉴定为艾叶。艾叶样本产地信息见表1。

表1 艾叶样本产地信息

2 方法

2.1 样本制备 取阴干艾叶适量，采用多功能粉碎机粉碎成细粉，精密称取100 g于圆底烧瓶中，加水1.2 L，以挥发油提取装置提取5 h，提取完毕读取挥发油体积后收集挥发油部分，经一次性注射器含0.22 μm的有机滤膜的滤头滤过后直接进行分析。

2.2 样本分析 采用岛津GC-MS-QP2010 Plus气相色谱质谱联用仪进行样品分析，色谱及质谱参数如下。色谱柱：HP-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；升温梯度：80～10 ℃/min，300 ℃，5 min；分流比：30∶1；恒线速度模式：30 cm/s；载气：He；离子源温度：200 ℃；接口温度：300 ℃；进样口温度：300 ℃；质量扫描范围：m/z 29～550；进样量：0.4 μL。

2.3 数据处理 原始数据导入Nist 2017标准谱库，经手动扣除背景干扰信息及解卷积后进行碎片离子信息比对，选取匹配度最高的成分进行确认，整理成分峰面积矩阵表。以所鉴定的共有成分作为样本信息，比较蕲春产艾叶与陕西产艾叶样本的共性和差异。将21个样本的峰面积矩阵表导入Origin 2021，选择中位数聚类法、平方Euclidean距离作为聚类参数，导出树状图分类结果。以挥发性成分峰面积为样本特征，以产地为变量，按照陕西和蕲春2个产地预先对样本进行分组，整理数据矩阵，采用MetaboAnalyst 5.0对21批艾叶样本原始数据分别经过平方根转换、帕累托转换，得到标准化数据矩阵后分别进行无监督的主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)[8]及有监督的偏最小二乘法判别分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA)[9]。PLS-DA模型进行内部交叉验证(Cross Validation)。最后，采用Origin 2021软件单独对陕西15个样本进行主成分分析，提取陕西产艾叶中挥发性成分的主成分特征，数据以主成分特征值、方差贡献率及累积贡献率进行评价。

3 结果

3.1 艾叶样本中挥发性成分鉴定 样本中成分的离子流主要集中于10～20 min之间，25 min后基本无色谱峰，说明样本中成分已经充分离子化。样本GC-MS总离子流见图1。初步鉴定到13个共有成分，匹配度均大于80。挥发性成分MS信息见表2。

图1 艾叶样本GC-MS总离子流图

表2 挥发性成分MS信息

3.2 蕲春与陕西产艾叶样本挥发性共有成分的整体聚类分析比较 所分析的21批次艾叶，以挥发性共有峰为主要特征，大体可聚为3类，其中8号(陕南)与12号(陕南)、17号(关中)、13号(陕南)距离较近，聚为一类，16号(关中)与其他所有样本都较远，单独聚为一类，蕲春样本与所有陕北样本、部分陕南、关中样本聚为一类。见图2。

图2 蕲春与陕西产艾叶样本聚类分析

3.3 蕲春与陕西产艾叶样本挥发性共有成分的整体多元分析比较 由各产地样本的PCA积分图(图3-A)的分布可知，蕲春和陕西产地样本特征整体重叠，蕲春样本(红色圆点)与陕西3个产区样本(绿色圆点)没有显示出明显分簇的状态，说明在整体特征上蕲春样本与陕西3个区域样本未能体现出差异。PLS-DA得分图也可发现蕲春和陕西产地样本依然没有明显的分簇(图3B)。为了验证PLS-DA模型的预测性能，对所建立的PLS-DA模型进行了内部交叉验证发现，在基于各主成分的验证中，模型的R2值均在0.5以下，Q2值出现负值(见图3-C)，这说明基于蕲春和陕西2个产地分组而建立的PLS-DA模型不能显示出2组样本的差异，对样本进行分组的模型建立不成功，从反面证实了PCA分析的结果。

图3 蕲春与陕西产艾叶样本挥发性共有成分的PCA、PLS-DA分析

3.4 陕西产艾叶样本中挥发性特征成分的主成分分析 总方差的76.04%贡献来自于主成分1，11.05%来自于主成分2，5.97%来自于主成分3，主成分1、2、3累计贡献了93.06%的方差，主成分1和主成分2合计贡献了87.09%方差，从统计出的累计方差结果来看，主成分1和主成分2已经基本可代表陕西产样本的主要特征，主成分1、2、3合起来能够更加全面代表陕西产艾叶样本的特征。见图4。对主成分1贡献率较大(系数大于0.6)的成分是α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龙脑、侧柏酮；对主成分2贡献率较大(系数大于0.6)的成分有薄荷醇、丁香酚、龙脑；对主成分3贡献率较大的成分有香芹酮、γ-松油烯。此部分的主成分分析结果表明，陕西不同产地艾叶中最主要的挥发性特征成分有α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龙脑、侧柏酮、薄荷醇、丁香酚、香芹酮、γ-松油烯。其中位于第1主成分的α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龙脑、侧柏酮是本文基于多元统计分析得到的核心成分群。

图4 陕西产艾叶样本主成分分析

4 讨论

本文对陕西代表性产区的艾叶样本进行了挥发性成分鉴定及多元统计分析，以期初步得到陕西产艾叶中挥发性成分特征。基于21批次的艾叶中的共有性挥发性成分，分别进行了聚类分析、整体多元统计分析和PCA。PCA是一种无监督的分析方法，默认所有样本对模型有着同样的贡献进行分析，当样本的组间差异较大，而组内差异较小时，无监督分析方法可以明显区分组间差异，当样本的组间差异不明晰，而组内差异较大时，无监督分析方法难以发现和区分组间差异。本文首先按照产地进行分组，分析蕲春组和陕西产艾叶2组的组间差异发现，PCA无法得出2组样本之间的差异，造成上述结果有2种可能，一种是2个产地样本之间确实没有统计意义上的显著差异，另一种可能是由于组内差异大于组间差异，此时采用PCA得出的结论将不合理。PLS-DA是一种有监督的分类模型，能够很好地解决无监督分析中遇到的这些问题。但为了避免PLS-DA模型存在的过拟合风险，常常采用内部交叉验证实验进行辅助评价所建立模型的预测性能[10]，内部交叉验证的参数Q2数值越大则表示模型的预测能力越好[11]。一般情况下，模型具备良好的预测性能要求Q2至少大于0.5[12-13]。本实验结果发现，Q2始终是负值，说明此处所建立的PLS-DA模型不能具备预测组间差异的可靠性能，也可以说从另一角度也说明了组间差异没有达到足以忽略组内差异，达到组间区分的程度。从PCA和PLS-DA结果均可以看出，陕西的15批次艾叶之间组成的团簇面积较大，说明陕西各个产地艾叶之间也具有一定差异，部分地区样本与蕲春样本较为接近，另一部分则区别较明显，这可能也是造成陕西产艾叶与蕲春产艾叶整体特征无差异的原因之一。此外，本文基于蕲春与陕西15个批次艾叶中共有成分进行了PCA、PLS-DA，对于陕西或蕲春艾叶中的特有成分目前无法共同分析，后期还将继续就蕲春产艾叶和其他产区艾叶的共性和特性开展工作。

目前，2020版《中华人民共和国药典》中对于艾叶的质量控制，仅限于桉油精和龙脑2个成分。本文基于主成分分析得出了在统计学意义上陕西产艾叶中的对主成分具有较大贡献的成分，可为陕西产艾叶的进一步质量评价研究提供实验依据，其中有不少成分也是文献[14-17]报道的与艾叶药理活性相关的成分，如龙脑具有抑菌、镇静安神等药效作用，与艾叶的整体药效作用相关。α-松油醇对指状青霉抑霉唑抗性菌株Pdw03具有明显抑制作用[18]。侧柏酮是一种类单萜酮[19]，是从金钟柏中分离得到的酊类能增强脾细胞和胸腺细胞增殖、增强细胞因子(如白细胞介素-2、γ干扰素)的作用，具有抗肿瘤能力[20]。此外，α-石竹烯、氧化石竹烯被报道具有镇痛抗炎活性等[21-22]，β-蒎烯已被证实具有抑菌、杀虫、抗肿瘤活性，α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉叶油醇、莰烯具有保护细胞氧化应激损伤；丁香酚、芳樟醇、紫苏醛的抗氧化、抗菌、抗肿瘤等药理活性均与艾叶的药理活性高度相关[23-26]。

本文仅从6批蕲春产艾叶和15批陕西产艾叶的13个共有性挥发性成分入手，初步的多元统计分析没有发现陕西产艾叶与蕲春产艾叶在共性成分特征上有显著差异，可为陕西产艾叶质量研究提供初步依据；但在今后的研究中，还需要对2个产地艾叶的差异性成分特征进行进一步分析，从而对陕西产艾叶的全面质量控制提供更加全面的数据支撑。

5 结论

本文采用GC-MS方法分析了蕲春及陕西产21批艾叶样本中挥发性成分，并以挥发性共有峰为样本特征，通过样本的聚类分析、PCA、PLS-DA和对成分的PCA，初步发现：陕西产艾叶与蕲春产艾叶在13个挥发性共有成分特征方面，没有明显差异；陕西产艾叶挥发性成分的主要特征成分有α-松油醇、桉油精、α-石竹烯、葎草烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、龙脑、侧柏酮、薄荷醇、丁香酚等。