分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定三七中农药及其代谢物残留

王丽，林昕，魏茂琼，陈兴连，林涛，刘宏程

(1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，昆明 650205； 2.农业部农产品质量监督检验测试中心，昆明 650205)

三七为五加科人参属多年生草本植物，主要产于云南省文山州等地，是预防和治疗心脑血管等疾病的传统中药材之一，有散瘀止血、消肿定痛等功效[1-3]。在三七人工种植过程中，不可避免地会喷施农药来防治各种病虫草害，可能存在农药使用过量或违规使用情况，从而导致药材中药物残留明显，影响用药者人身安全[4]。因此建立残留分析技术对三七等中药材中农药残留分析监测，对保障人民身体健康及推进中医药产业健康发展具有重要意义。氨基甲酸酯和有机磷类等杀虫剂被广泛用于中药材种植中病虫害防治。目前，对中药材中氨基甲酸酯类农药分析有一些报道[5-6]，但主要针对农药母体的监测，忽略了相关代谢物残留的同时分析。研究发现部分农药代谢物毒性远高于农药母体[7]，农药及其代谢物的同时监测，对食品安全更有意义。笔者选取几种杀虫剂类农药：克百威、涕灭威、氟虫腈、水胺硫磷，对以上农药代谢物同时分析。以上农药在三七等中药材种植中属于禁用农药，但可能存在违规错误使用情况，对三七中几种禁用农药及其代谢物残留同时分析对中药材安全性具有重要意义。

中药材中禁限用农药残留分析有一些报道[8-9]，但三七中以上几种禁用农药的研究报道不多。张举成等[5-6]只测定了三七中几种氨基甲酸酯中母体农药残留，没有代谢物分析，且采用的固相萃取前处理相对复杂、耗时。氟虫腈及代谢物在三七中的分析鲜少报道。目前，分散固相萃取技术因其操作快速、简便等优点已被广泛应用在农药残留分析中[10-12]。在贝母、山海棠有等中药材的农药分析中有一定应用[13-14]，在三七农药检测中的应用报道相对较少。与传统色谱方法对比，液相色谱-串联质谱(LCMS/MS)技术选择性和灵敏度更好，针对中药材等复杂样本的抗基质干扰能力更强[15]。笔者以中药材三七为研究对象，对色谱、质谱及分散固相萃取法提取净化等相关参数进行优化，建立针对三七中农药及代谢物残留量的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱同时快速检测方法，为中药材产品中药物及代谢物残留分析提供基础实验依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：5500 型，美国AB SCIEX 公司。

电子分析天平：JJ200 型，感量为10 mg，江苏省常熟市双杰测试仪器厂。

超声波清洗仪：KQ-500DB 型，昆山市超声仪器有限公司。

高速离心机：TGL-10B-6D 型，上海安亭科学仪器厂。

超纯水仪：MILLI-Q 型，美国密理博公司。

涡旋振荡器：Vortex3 型，德国艾卡公司。

克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、水胺硫磷、氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫化物标准样品：1 000 µg/mL，农业部环境保护科研监测所。

乙腈、甲醇：色谱纯，德国默克公司。

氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司。

乙酸铵、甲酸、乙酸：色谱纯，美国Sigma 公司。

PSA(N-丙基乙二胺)、NH2(丙氨基键合硅胶)、C18(十八烷基键合硅胶)、弗罗里硅土、GCB(石墨化炭黑)净化材料：粒径为50～100 μm，天津艾杰尔公司。三七样品：市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美 国Waters 公 司)；流 动 相：A 相 为甲醇，B 相为5 mmol/L 乙酸铵溶液(含质量分数 为0.05% 的 甲 酸)，流 量 为300 μL/min；梯度 洗 脱 程 序：0～5 min，5% A～95% A，5～8 min，95% A～95% A，8～8.1 min，95% A～5% A，8.1～10 min，5% A；柱温：40 ℃；进样体积：1.0 μL。

1.2.2 质谱仪

采用多反应监测模式(MRM)，ESI 源下正离子和负离子进行同时扫描；电喷雾电压：正源为5 500 V，负源为-4 500 V；离子源温度：550 ℃；气帘气压力：0.227 MPa；雾化气压力：0.345 MPa；辅助加热气压力：0.379 MPa。每种农药质谱参数见表1。

表1 10 种农药的色谱、质谱参数

1.3 实验步骤

1.3.1 标准溶液配制

准确吸取克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、水胺硫磷、氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫化物标准样品各1.00 mL，用甲醇配制成质量浓度均为10.0 µg/mL 的标准储备溶液，用移液管准确移取一定体积上述各储备标准液，混合并用甲醇稀释定容，得到混合标准溶液，于低温避光条件下保存。系列标准工作溶液用甲醇和空白基质配制，现用现配。

1.3.2 样品处理

称取2 g(精确至0.01 g)三七粉末试样放入50 mL 离心管中，之后加入10.0 mL 去离子水，涡旋震荡1 min 后放置30 min，三七干粉试样应充分浸润，向离心管内加入20.0 mL 乙腈作为提取溶剂，涡旋混合振荡提取1 min，再加入6.0 g 氯化钠，剧烈振荡提取1 min，超声辅助提取30 min，于8 000 r/min转速下离心3 min，取上层清液1 mL 至内含40 mg PSA、40 mg NH2、20 mg GCB 净化离心管中，涡旋振荡提取20 s，以8 000 r/min 转速离心3 min 后，取上层清液过0.22 μm 滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.3 定量方法

采用基质匹配的标准曲线外标法进行各农药定量分析。在1.2 仪器工作条件下，将系列浓度的基质标准工作溶液上机分析，绘制标准曲线，将待测样品上机分析，计算农药含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化

各种农药的离子化效率以及色谱保留时间受流动相体系的影响较大。分别采用甲醇和乙腈作为流动相中的有机相，考察目标农药色谱分离情况。结果表明，甲醇作为流动相时10 种农药分离效果更好，所以选择甲醇作为有机相。由于各农药的结构性质不同，克百威、涕灭威及代谢物等容易在ESI 源正离子电离模式下形成[M+H]+[M+Na]+物质离子峰，在流动相中加入适当浓度的酸性物质可以促进目标物的正离子化效率。但在氟虫腈及代谢物的结构中，存在数目较多的强吸电子基团(F、Cl、CN)，使得分子中的氢质子极易失去，易形成负离子，加入乙酸铵等缓冲盐能够改善待测组分峰形，在一定程度上能提高目标物的响应灵敏度[16]。综合考虑不同农药的化学性质，最终选择甲醇、5 mmol/L 乙酸铵溶液(含质量分数为0.05%的甲酸)为流动相体系，10 种目标化合物响应值和色谱峰形等综合达到最优状态。

2.1.2 质谱条件的优化

选择在ESI 源的正离子和负离子模式下同时扫描方式。采用针泵直接进样方式对10 种目标农药(0.1 μg/mL)进行一级质谱扫描，获得稳定的母离子准离子峰，然后对其进行二级碎片扫描，获得目标农药的二级子离子质谱信息。筛选2～3 个信号较强的二级碎片离子作为子离子，并在MRM 模式下分别优化去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)、毛细管电压及离子源温度等质谱参数。定量和定性离子最终选取响应强度高并且基质干扰小的两对离子。确定的最优质谱条件参数见表1。

2.2 样品处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂

农药残留分析多选择甲醇、乙腈等有机溶剂作为提取试剂。笔者采用加标回收法对提取试剂选择优化，以甲醇作为提取剂时共提取的干扰杂质较多，影响后期净化处理，同时甲醇与加入的水互溶，不利于分析。乙腈渗透能力强，作为提取试剂总体回收率较好，提取效果好，所以选用乙腈作为提取试剂。

2.2.2 提取溶剂体积

向三七样品中添加20 μg/kg 浓度水平的10 种农药，分别加入10、15、20、25 mL 乙腈溶剂，考察目标农药的提取效果。结果显示，加入20 mL 乙腈时各农药提取效果相对较好，继续增加体积，提取效果没有明显提升。所以最终确定提取溶剂乙腈的加入体积为20 mL。

2.2.3 净化条件

首先将未净化的提取上清溶液直接过膜进样分析，结果显示各目标农药的回收率均大于120%，可能由于三七提取液内含成分复杂，产生一定的基质效应，且不净化直接进样易造成离子源污染。因此需选择合适高效快捷的净化方法对样品提取液净化，以降低三七中有机质等对目标农药分析的影响。

选择高效的分散固相萃取法作为样品净化方法，对C18、PSA、NH2、弗罗里硅土、GCB 5 种净化材料的种类和用量加以选择优化。在1 mL 的上清提取液中分别加入上述净化材料100 mg(GCB 20 mg)，结果显示，10 种目标农药提取率在83%～115%之间，说明5 种净化材料均能满足净化要求，但用PSA、NH2、GCB 净化后的提取液颜色较浅，净化效果相对更好。由于不同净化材料对干扰物吸附性能不同，最终选择PSA、NH2、GCB 的混合材料作为本实验的净化材料，并对各净化材料的用量比例(PSA、NH2和GCB的质量比分别为1∶3∶1、2∶2∶1、3∶1∶1)和总用量(50、100、150、200 mg)进行优化。结果显示，对于克百威、涕灭威及代谢物当用量比例为1∶3∶1、2∶2∶1 时净化效果较好，当用量比例为2∶2∶1、3∶1∶1 时氟虫腈及代谢物净化效果相对更好，但对于水胺硫磷用量比例为2∶2∶1 时净化效果最好。综合考虑，最终确定选择PSA、NH2和GCB的质量比2∶2∶1。对净化材料总用量进行优化，当用量大于100 mg 时，净化效果没有明显增强，因此，最终选择总用量为100 mg。

此外，试验结果表明，用传统的固相萃取方式(HLB 固相萃取柱)对样品提取液进行净化，回收率为88.3%～113.1%，方法同样满足要求，但相比之下，分散固相萃取法更加简便快速、成本低，更适用于大批量样品的残留分析检测。

2.3 基质效应

基质效应现象(ME)是样品提取过程中共提取的杂质干扰物会对目标分析物的仪器响应产生影响，表现为对分析物响应增强或抑制。分别配制相同质量浓度各农药的溶剂和基质系列标准溶液，分别以色谱峰面积和质量浓度绘制标准曲线，基质效应(ME)的强弱通过对基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率比较计算值进行评价。当|ME|＜20%时为弱基质效应；当20%≤|ME|＜50%时为中等强度基质效应；当|ME|≥50%时为强基质效应[15]。结果表明(见表2 )，仅有克百威、涕灭威、水胺硫磷表现为中等基质效应，其余农药均表现为弱基质效应。为减小基质效应的影响，笔者采用基质匹配的标准曲线进行各农药定量分析。

2.4 线性关系、检出限及定量限

配制10 种农药的系列混合基质标准溶液，在1.2 仪器工作条件下，以各农药的色谱峰面积对其质量浓度进行线性回归，计算线性方程和相关系数。

以3 倍信噪比添加浓度作为方法检出限(LOD)，以10 倍信噪比的添加浓度作为方法定量限(LOQ)。

10 种农药的线性方程、线性范围、相关系数、检出限见表2。由表2 可知，10 种农药在0.001～0.2 μg/mL 线性范围内相关系数均大于0.998，表明线性关系良好，方法检出限为0.3～2.8 μg/kg，该方法中10 种农药的检出限较低，能够满足农药残留的分析要求。

表2 10 种农药的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及基质效应

2.5 加标回收与精密度试验

采用三七空白基质，分别以约1 倍、5 倍、10 倍各农药的定量限进行低、中、高三个浓度水平加标回收试验，每个添加浓度水平做6 个平行试验，用基质标准曲线进行定量，结果见表3。空白样品、加标样品色谱图如图1、图2 所示。由表3 可知，10 种农药的平均回收率为90.4%～110.5%，相对标准偏差小于7.9%，表明建立的方法回收率和重现性较好，符合农药残留测定的要求，适用于三七中10 种农药及相关代谢物残留的同时测定。

图1 空白三七样品色谱图

图2 空白三七样品加标色谱图

表3 10 种农药的加标回收与精密度试验结果(n=6) %

续表3

3 结语

建立了一种采用分散固相萃取净化方式的超高效液相色谱串联质谱快速测定三七中农药及代谢物残留的方法。样品经乙腈提取，提取溶液通过PSA、NH2和GCB 混合材料净化，以基质标准曲线定量，能快速实现三七中农药及代谢物的含量分析。该方法具有较好的准确度和精密度，满足复杂基质中痕量农药分析要求，且简单、快速、稳定，可用于批量三七样品中农药及代谢物残留的快速分析测定。本研究可为中药材产品中农药及代谢物残留分析提供实验基础数据。