高效液相色谱-串联质谱法快速测定清咽类保健食品中14 种激素类药物
2022-12-28张晓娟李冬云陈立波陈洁
张晓娟，李冬云，陈立波，陈洁
[玉林市食品药品检验检测中心化学室，玉林中药材(含香辛料)质量监测与评价工程技术研究中心，广西玉林 537000]
清咽类保健食品是具有一定清咽利喉作用的特殊食品，能缓解喉部不适的症状，需求量日益增加。市场上的清咽保健食品品种繁多，但质量良莠不齐，甚至有商家为了增加产品效果，违法添加药物以期达到起效快的目的，添加的品种涵盖止咳平喘类、抗生素类、激素类等，对消费者健康造成严重危害。国内学者对清咽类中成药非法添加的化学成分研究较多[1-15]，但针对清咽类保健食品非法添加成分研究较少，激素类药物具有强大的抗炎作用，若长期服用，可能会引起库欣综合征，给消费者带来很大的安全隐患。
非法添加激素类药物的检测方法主要有TLC法[3]、液相色谱法[4]和液相色谱-串联质谱法等[5]，曲安西龙、泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氟米龙、氟氢可的松醋酸酯、地夫可特、泼尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、地塞米松醋酸酯是在清咽类保健食品中发现的非法添加激素类药物，现有文献中尚无同时检测清咽类保健食品中该14 种激素类药物的方法，一些文献中测定的激素类化学成分不够全面[16-23]，不法分子可能存在为逃避执法而添加标准限制外的成分，需要尽可能全面覆盖种类进行筛查。因此笔者建立高效液相色谱-串联质谱法测定清咽类保健食品中可能添加的14 种激素类药物，以期为其安全生产和质量控制提供参考，同时进一步完善清咽类保健食品中非法添加多成分分析的检测方法。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
液相色谱-质谱联用仪：Xevo-TQ-Smicro 型，美国沃特世公司。
电子分析天平：S-205DU 型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司。
数控超声波清洗器：KQ-250DB 型，昆山市超声仪器有限公司。
超纯水仪：Milli-Q 型，美国密理博公司。
甲酸：优级纯，上海安谱科学仪器有限公司。
清咽类保健食品样品：含片，市售。
其它所用试剂均为分析纯。
实验用水：GB/T 6682 规定的一级水。
14 种激素类药物标准物质：名称、纯度及生产单位等见表1。
表1 14 种激素类药物标准物质信息
续表1
1.2 仪器工作条件
1.2.1 色谱
色谱柱：Agilent SB-C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：35 ℃；进样体积：5μL；流动相：A 相为水，B 相为乙腈，流量为0.3 mL/min，梯度洗脱，洗脱程序见表2。
表2 梯度洗脱程序
1.2.2 质谱
离子模式：ES+；毛细管电压：2.50 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；锥孔气：氮气，流量为20 L/h；脱溶剂气：氮气，流量为1 000 L/h；14 种激素类化合物质谱参数见表3。
表3 14 种激素药物的质谱参数
续表3
1.3 实验步骤
1.3.1 样品溶液的制备
称取样品0.2 g，置于15 mL 具塞离心管中，加入少量50%(体积分数，下同)的乙腈溶液，涡旋30 s 至试样与提取溶剂混合均匀，然后加入50%的乙腈溶液至近10 mL，超声提取20 min，静置至室温，用50%的乙腈溶液定容至10 mL，摇匀，以10 000 r/min 离心5 min，经0.22 μm 滤膜滤过，滤液作为样品溶液。
1.3.2 阴性样品溶液的制备
参考样品说明书提供的配方原料，取金银花、胖大海、青果、桔梗、麦冬、甘草、罗汉果、菊花、枇杷等中药各2～10 g，加水500 mL 煎熬30 min，制成阴性样品溶液。
1.3.3 标准溶液的制备
混合标准储备溶液：分别精确称取14 种激素类化合物标准样品各10.00 mg(精确至0.01 mg)，置于不同的20 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，混匀，得质量浓度为500 μg/mL 的单一标准溶液。精密量取14 种单一标准溶液各1 mL 至100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀，制得混合标准储备溶液，其中各组分质量浓度均为5 μg/mL。
系列标准工作溶液：取6 只10 mL 容量瓶，依次精密加入混合标准储备溶液10、20、40、60、80、100 μL，用甲醇稀释并定容，摇匀，制得系列标准工作溶液，其中14 种组分的质量浓度均分别为5、10、20、30、40、50 ng/mL。
1.3.4 定量方法
按1.2 仪器工作条件测定系列标准工作溶液，以质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，计算得线性方程，以标准曲线法定量。
2 结果与讨论
2.1 提取方法优化
清咽类保健食品样品均是含糖量较高的含片，需要用水溶解才能易于测定，14 种糖皮质激素的极性较小，在弱极性或中等级性有机溶剂中有较高的溶解性，参考文献[13]，分别选择甲醇、乙腈及体积分数均为50%的甲醇溶液、乙腈溶液及体积分数均为75%的甲醇溶液、乙腈溶液6 种溶剂作为提取溶剂，超声提取时间分别设置为10、20、30 min，进行样品提取试验。结果显示，6 种提取溶剂中，乙腈提取效果好于甲醇，而体积分数为50%的乙腈溶液稍高于其它；超声提取时间在20 min 的提取率比10 min高，与30 min 无明显区别。综合考虑提取时间和提取率，选择使用体积分数为50%的乙腈溶液作为提取溶剂，超声时间为20 min。
2.2 色谱条件的优化
14 种激素具有相似的母核结构，极性较弱且难以分离。实验考察了Agilent SB-C18、Waters ACQUITY UPLC BEH 及CAPCELL CORE C18这3种型号的色谱柱，对14 种化合物进行分离，结果发现使用CAPCELL CORE C18柱色谱峰峰形较理想，但分离度不高，不如Agilent SB-C18柱的分离效果；使用Waters ACQUITY UPLC BEH 柱各成分基本实现分离，但色谱峰形不理想；使用Agilent SB-C18柱色谱峰形较好，响应值高。故选择Agilent SB-C18色谱柱进行分离。
实验考察了乙腈-水和甲醇-水的流动相系统，结果发现含有乙腈的流动相比含有甲醇的流动相保留时间缩短，多数成分色谱峰形较好，响应值也较高。通过梯度洗脱可以实现目标化合物有效分离。因此最终采用乙腈-水流动相系统梯度洗脱。
2.3 质谱条件的优化
在电喷雾离子源的正离子模式和负离子模式下，分别对质量浓度为5 μg/mL 混合标准溶液进行一级质谱全扫描分析，获得准分子离子或加合离子。扫描结果表明：在负离子模式下大部分目标物质离子的相对丰度多数不到正离子模式下的1/2，因此实验在正离子模式下进一步优化质谱条件，通过改变碰撞能量和锥孔电压，选择信号较强、干扰较小的子离子对，其中丰度相对较大的为定量离子，另一个为定性离子，在MRM 模式下对2 个碎片离子进行优化，确定最佳的质谱条件见表2。14 种激素类药物的总离子流图见图1，监测离子色谱图见图2～图15。
图1 14 种激素类药物的总离子流色谱图
图2 曲安西龙的监测离子色谱图
图3 泼尼松龙的监测离子色谱图
图4 泼尼松的监测离子色谱图
图5 氢化可的松的监测离子色谱图
图6 可的松的监测离子色谱图
图7 甲基泼尼松龙的监测离子色谱图
图8 倍他米松的监测离子色谱图
图9 地塞米松的监测离子色谱图
图10 氟米龙的监测离子色谱图
图11 氟氢可的松醋酸酯的监测离子色谱图
图12 地夫可特的监测离子色谱图
图13 泼尼松醋酸酯的监测离子色谱图
图14 可的松醋酸酯的监测离子色谱图
图15 地塞米松醋酸酯的监测离子色谱图
2.4 线性关系与检出限
在1.2 仪器工作条件下，分别测定系列标准工作溶液，以溶液的质量浓度x为横坐标、色谱峰面积y为纵坐标进行线性回归，计算线性方程和相关系数。分别以定量离子的3 倍、10 倍信噪比对应的样品中目标物质量分数为方法检出限和定量限。
14 种激素类化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限列于表4。结果表明各组分质量浓度在5～50 ng/mL 范围内线性良好，相关系数均大于0.990，检出限为0.002～0.211 μg/g，定量限为0.007～0.704 μg/g。
表4 14 种激素类药物的线性范围、线性方程、检出限与定量限
2.5 加标回收与精密度试验
称取阴性样品9 份，分别添加3 种不同浓度混合标准溶液，高、中、低浓度添加混合标准储备液体积分别为20、40、60 μL，在1.2 仪器工作条件下分别测定，测定结果列于表5。由表5 可知，测定结果的相对标准偏差分别为1.1%～2.3%，平均加标回收率为92.1%～104.0%，表明该方法在不同添加水平均有较好的回收率和重复性，方法的准确度和精密度满足实验要求。
表5 加标回收与精密度试验结果(n=9)
3 结语
建立了液相色谱仪串联质谱法对清咽类保健食品中14 种激素类药物同时定量、定性测定，该方法能在20 min 内对14 种成分进行快速筛查，在实际应用中可进行清咽类保健食品中是否非法添加14 种激素类化学药物进行快速筛查。该方法操作简单，灵敏度高，能短时间同时测定多种激素类药物，满足目标分析物的定性和定量要求，为开展清咽类保健食品非法添加的检测及风险评估，加强食品安全质量监管提供技术支持。
