美洲大蠊成虫肠道抗细菌共生放线菌的筛选及鉴定

殷鹏凯, 王明明, 杨自忠, 杨大松, 杨银河

(大理大学药学院, 云南省昆虫生物医药研发重点实验室, 云南 大理 671000)

病原菌感染是全球公共健康面临的主要威胁之一，其导致的死亡人数在逐年上升，2017年全球范围内就有超过800万人因感染病原体而死亡(Ordonezetal., 2019)。尽管抗生素是治疗感染性疾病的有效手段，但新型抗生素寻找速率的降低以及耐药病原菌的出现，给现代医学带来了新的挑战(Jacksonetal., 2018)。因此，挖掘抗生素新来源和寻找安全高效的抗菌物质不仅是医药研究的前沿领域，也是国家重大的战略需求(刘昌孝, 2017)。

昆虫是地球上数量最大、种类最多、分布最广的生物类群(Stork, 2018)，许多特异微生物已与昆虫形成共生关系并发挥重要作用，如黄蜂和甲虫的共生菌能产生抗菌物质帮助宿主抵御病原菌的侵害，表明昆虫共生菌是开发抗菌药物的重要生物资源(Kaltenpoth, 2009)。 美洲大蠊Periplanetaamericana属于节肢动物门(Arthropoda)昆虫纲(Insecta)蜚蠊目(Blattaria)，作为中国传统中药材蜚蠊的代表性虫种，目前已以其提取物为主成分制成康复新液、肝龙胶囊、心脉隆注射液等药物(高阳阳等, 2021)；同时，作为一种世界卫生害虫，它能在污水管道和化粪池等污染环境中长期自由生活(Leeetal., 2012)，表明其具有超强的抗病能力，是研究抵御病原菌机制、探寻抗菌物质的良好材料。研究发现，美洲大蠊肠道内含有丰富的微生物(Tinker and Ottesen, 2016)。安然(2009)对厦门室内的美洲大蠊肠道放线菌进行抗菌活性测试，发现了一些抗菌活性较弱的放线菌；而蒋诗林等(2021)在广东室外的美洲大蠊肠道内则发现了一些抗菌活性较强的放线菌，表明美洲大蠊肠道内含有抗菌活性的放线菌，其超强抗病能力可能与其肠道内微生物菌群有密切关系，而且不同的生存环境可能会对共生菌的抗菌活性产生影响。

作者以来源于云南省大理白族自治州的野外美洲大蠊为研究材料，从其肠道中共分离得到41株放线菌，以金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌Escherichiacoli、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、粪肠球菌Enterococcusfaecalis和鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium共6种人体常见病原细菌为指示菌，采用牛津杯法对这些放线菌进行体外抗病原细菌活性筛选，并结合菌落特征观察和分子生物学方法，对具有广谱和明显抗菌活性的菌株进行分类鉴定，为后续发现新型抗菌物质提供微生物资源。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与指示菌

供试美洲大蠊成虫于2020年7月在云南省大理白族自治州弥渡县室外垃圾堆附近捕捉。采集的样品经由大理大学昆虫生物医药研发重点实验室杨自忠教授根据形态特征进行核实(李军德等, 2013)，确为美洲大蠊。

用作抗菌活性指示菌株的6种病原细菌中，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠杆菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌 (ATCC9027)和粪肠球菌(ATCC47077)由昆虫生物医药研发重点实验室菌种储藏库提供，鼠伤寒沙门氏菌(CMCCB50222, BNCC103281) 购自北纳生物科技有限公司，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)(ATCC43300)购自广东省科学院微生物研究所。

1.2 培养基和主要试剂

病原细菌的培养基为LB培养基，放线菌纯化培养基为高氏Ⅰ号培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；为抑制真菌和其他细菌生长，向高氏Ⅰ号培养基中添加重铬酸钾(西陇科学股份有限公司)，终浓度为50 μg/mL，此作为放线菌分离培养基。所有培养基均用超纯水配制，经高温蒸汽灭菌30 min后使用。

主要试剂包括氯霉素和盐酸万古霉素(上海麦克林生化科技有限公司)、细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)、PCR产物磁珠法纯化试剂盒(硕美公司)，PCR预混液、DNA Ladder和PCR引物购自北京六合华大基因科技有限公司。

1.3 肠道共生放线菌的分离、纯化及保存

取采集的美洲大蠊成虫样品10头，先置于-20℃的低温冰箱20 min，使其进入昏迷状态，然后采用表面消毒法(Bertino-Grimaldietal., 2013)进行处理：先用流水冲洗，75%乙醇浸泡3 min，3.5%次氯酸钠溶液浸泡1 min，最后用无菌水洗涤3次。用无菌滤纸将美洲大蠊样品外表擦干。剪去其触角、附肢以及翅。从侧面将美洲大蠊的腹部剖开，取出肠道，放入玻璃研磨器中，加入5 mL无菌水研磨，静置后取上清液1 mL稀释至不同的浓度(10-2～10-6g/mL)，吸取各浓度的稀释液0.1 mL，均匀涂布于含有50 μg/mL重铬酸钾的高氏Ⅰ号培养基平板上，每个浓度3个平行实验，将培养皿倒置于培养箱中，28℃培养。待平板上长出可见菌落后，根据菌落的形态特征(呈菌丝状生长，大多有发达的分支菌丝，以孢子繁殖，菌落颜色不一)、隆起程度、边缘整齐度等特征挑选出不同的放线菌，接种于高氏Ⅰ号培养基平板上。每个菌落至少纯化5次以上以得到单一菌落，以40%甘油为冻存液将菌种于-80℃保存。

1.4 肠道放线菌的抗菌活性测试

菌株的小规模发酵：将已纯化菌株从低温冰箱取出，经37℃水浴解冻后，划线接种到高氏Ⅰ号琼脂培养基平板上活化，置28℃培养7 d。 将活化的纯化菌株扩大培养至10个高氏合成Ⅰ号琼脂培养基平板，于28℃培养14 d，以生成足够次生代谢产物。

菌株代谢粗提物的制备：将培养基平板的琼脂切割成等厘米见方的小块置于500 mL锥形瓶中，以乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=80∶15∶5(v/v)的配比液浸泡3次，每次间隔3, 2和1 d。将每次的浸泡液用滤纸进行过滤，合并3次滤液旋蒸至干，称取代谢粗提物约50 mg备用，剩余样品在4℃保存备用。

分离放线菌次生代谢粗提物的抗菌活性测试：方法基本同Ju等(2021)。按1%的接种量把6种指示病原细菌接入到10 mL LB液体培养基中，置于全温振荡培养箱以37℃和200 r/min条件培养3～4 h，调整菌液浓度至1×106CFU/mL。吸取0.1 mL菌液均匀涂布于LB培养基平板上，夹取牛津杯放置在平板上，并向杯中加入100 μL的待测样品(浓度为20 mg/mL)，把培养平板置于生化培养箱中，以37℃培养12 h，记录抑菌圈直径，计算其平均值。设盐酸万古霉素、氯霉素(浓度为200 μg/mL)为阳性对照组药物，每组实验设置3个重复实验。抑菌圈平均直径在10～12 mm判断为弱抑制作用，12～14 mm为中度抑制作用，大于14 mm为明显抑制作用。

1.5 抗菌活性菌株的形态特征观察

将抗菌活性放线菌接种于高氏Ⅰ号琼脂培养基上，于28℃培养7 d，从菌落形态、孢子颜色、边缘形状、是否产生色素等方面观察培养基上菌株的表观形态。

1.6 抗菌活性菌株的16S rRNA基因测序、同源性比对及系统发育分析

按照细菌基因组DNA抽取试剂盒说明书步骤提取放线菌DNA，使用16S rRNA基因扩增通用引物(Dongetal., 2017)27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′和1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3′，对筛选出的抗菌活性放线菌进行16S rRNA基因PCR扩增。PCR反应体系(30 μL): Super Mix 15 μL, 上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL, 模板(1 ng/μL)1 μL, ddH2O 12 μL。扩增程序: 96℃ 5 min; 96℃ 20 s, 62℃ 20 s, 72℃ 30 s, 共35个循环；72℃ 10 min。取3 μL PCR产物(1 500 bp)进行1.0%的琼脂糖凝胶检测。

将PCR产物委托北京六合华大基因科技有限公司进行16S rRNA基因测序，将所得序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，取相似性最高者作为参照菌株，在MEGA11软件(Tamuraetal., 2021)中采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树(Gunathilakaetal., 2020)，Bootstrap抽样重复1 000次，所构建的发育树各节点数值代表自展的重复比例。

2 结果

2.1 美洲大蠊肠道放线菌的分离纯化

选择适高氏Ⅰ号琼脂培养基平板为分离菌株用平板，挑选出不同形态特征的菌株进行培养，经5次以上分离纯化，共获得41株美洲大蠊肠道共生放线菌，记录编号为PAS1-PAS41，于-80℃保存。

2.2 抗菌活性放线菌菌株的筛选

为了确保实验数据的有效性，采用牛津杯法测定阳性对照组药物对6种人体病原细菌的抑菌圈直径，分析抗菌活性，其中盐酸万古霉素对MRSA的抑菌圈直径为15.50±0.75 mm，氯霉素对除MRSA和铜绿假单胞菌之外的其他4种病原细菌抑菌圈直径均大于14 mm，表明均具有较强的抗菌活性(表1)。

表1 阳性对照药物对6种人体病原细菌的抑菌圈直径(mm)Table 1 Inhibition zone diameters (mm) of positive control drugs against six human pathogenic bacteria

抗菌实验结果显示，41株美洲大蠊肠道分离放线菌中有34株(82.9%)对至少1种指示细菌具有抑制作用。对这些活性菌株的抗菌作用分析发现，1株(PAS6)对5种指示细菌均有抑制作用，有6株(PAS1, PAS3, PAS4, PAS8, PAS30和PAS36)对4种指示细菌有抑制作用，有2株(PAS5和PAS17)对3种指示细菌有抑制作用(表2)。

表2 美洲大蠊成虫肠道抗菌活性放线菌的抑菌圈直径(mm)Table 2 Inhibition zone diameters(mm) of actinomycetes with antibacterial activity from the guts of Periplaneta americana adults

基于前人提出的抑菌圈大小的抑制程度判断标准(Bibietal., 2011)，发现3株(PAS4, PAS6和PAS30)对大肠杆菌中度抑制，4株(PAS3, PAS5, PAS30和PAS36)对金黄色葡萄球菌明显抑制，5株(PAS8, PAS21, PAS28, PAS35和PAS37)对MRSA明显抑制，1株(PAS36)对粪肠球菌明显抑制，1株(PAS28)对铜绿假单胞菌明显抑制，但所有放线菌对鼠伤寒沙门氏菌的抑制均较弱。部分放线菌的抑制活性如图1所示。结果表明美洲大蠊肠道内存在广谱(抑制3种以上病原细菌)和抗菌活性明显(抑菌圈平均直径≥14 mm)的放线菌，其中具广谱抗菌活性的共有7株，为PAS1, PAS3, PAS4, PAS6, PAS8, PAS30, PAS36；具明显抗菌活性的有9株，为PAS3, PAS5, PAS8, PAS21, PAS28, PAS30, PAS35, PAS36和PAS37。

图1 美洲大蠊成虫部分肠道放线菌代谢粗提物对6种人体病原细菌的抑制活性Fig. 1 Inhibitory activities of crude metabolic extracts from some gut actinomycetes of Periplaneta americanaadults against six human pathogenic bacteria照片A-F分别显示菌株PAS30、PAS5、PAS8、PAS36、PAS6和PAS28的代谢粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、MRSA、鼠伤寒沙门氏菌、粪肠球菌和铜绿假单胞的抑制作用；其中照片C中使用盐酸万古霉素作为阳性对照药，其他照片中使用氯霉素作为阳性对照药。Photos A-F display the inhibitory effects of crude metabolic extracts of strains PAS30, PAS5, PAS8, PAS36, PA6 and PAS28 on Escherichia coli, Staphylococcus aureus, MRSA, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa, respectively. In photo C, vancomycin hydrochloride was used as the positive control drug, while in other photos, chloramphenicol was used as the positive control drug.

2.3 抗菌活性放线菌菌株的形态特征

对上述具广谱抗菌活性或明显抗菌活性的12株放线菌(PAS1, PAS3, PAS4, PAS5, PAS6, PAS8, PAS21, PAS28, PAS30, PAS35, PAS36和PAS37)的菌落形态进行观察，发现其菌落形态差异较大(图2)。

图2 美洲大蠊成虫肠道中具有抗菌活性的12株放线菌在培养基上的生长形态Fig. 2 Growth forms of 12 actinomycetes strains with antibacterial activity from the guts of Periplaneta americana adults on media菌株在高氏Ⅰ号琼脂培养基上培养，28℃生长7 d后拍摄。Strains were cultured on Gao I agar medium and photographed after growing at 28℃ for 7 d.

2.4 抗菌活性放线菌菌株的分子鉴定及系统发育

PAS1等12株活性菌株经PCR扩增到的16S rRNA基因长约1 500 bp，利用MEGA11软件，经BLAST比对序列同源性，构建系统发育树，初步鉴定这12株放线菌均为链霉菌属Streptomycesspp.。其中菌株PAS28, PAS36, PAS4, PAS5和PAS8之间的亲缘关系较近，PAS35和PAS1间的亲缘关系较近，PAS6和PAS3间的亲缘关系较近，PAS30与其他菌株的亲缘关系远，表现出美洲大蠊肠道链霉菌的多样性(图3)。将12株链霉菌的16S rRNA基因序列提交至GenBank数据库，登录号分别为OL677377-OL677381, OM421793, OM421794, OM421797和ON146335-ON146338。

图3 邻接法构建的基于16S rRNA基因序列的美洲大蠊成虫肠道中具有抗菌活性的12株放线菌和其他菌种的系统发育树(1 000次重复)Fig. 3 Phylogenetic tree of 12 actinomycetes strains with antibacterial activity from the guts of Periplaneta americana adults and other species based on the 16S rRNA gene sequences constructed by neighbor-joining method (1 000 replicates)标尺示遗传距离。Scale bar indicates the genetic distance.

3 讨论

昆虫肠道共生菌是一类特境微生物，在与宿主长期共生和协同进化过程中，可产生抗菌活性物质保护宿主防御外来病原菌感染(Arangoetal., 2016)。美洲大蠊是一类常见的病媒生物，长期携带病原菌却不受影响，其强大的抗病能力可能与肠道微生物相关。但目前关于美洲大蠊体内微生物的抗细菌活性研究尚不丰富，蒋诗林等(2021)测试了美洲大蠊肠道放线菌对金黄色葡萄球菌与MRSA两种病原细菌的拮抗作用，但对于其他类型病原细菌的抑制作用未见报道。

本研究从云南省大理州捕捉的野外美洲大蠊肠道内分离到41株放线菌，以3种革兰氏阳性和3种革兰氏阴性病原菌为指示菌株，采用牛津杯法定量测定了这些放线菌的潜在抗菌活性。结果发现，分离放线菌对革兰氏阳性菌的抑菌效果较好，其中以抗MRSA的菌株数量最多，有20株(48.7%)。据报道，在广东室外的美洲大蠊肠道放线菌中也曾发现一些抗MRSA的放线菌(蒋诗林等, 2021)，但这些放线菌的形态及种属分类与本实验分离到的差异较大，说明宿主的生存环境可影响其肠道内共生菌的类群组成。此外，本研究分离的多数放线菌对革兰氏阴性病原菌只有微弱的抗菌活性，但也有一部分菌株对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性病原细菌具有中度或明显的抑制作用，如菌株PAS4, PAS6, PAS24, PAS28和PAS30(表2)。结果揭示了在恶劣环境下生存的美洲大蠊，其肠道放线菌的抗细菌活性丰富多样，推测这些菌株产生的抗菌活性天然物质有助于美洲大蠊抵御外来病原细菌的感染。

对具有广谱和明显抗菌活性的放线菌进行分类鉴定，发现这些放线菌均归属于链霉菌属；链霉菌属是至今放线菌中种类最多、数量最大的一个属，是一类具有重要应用价值的微生物(Tiwari and Gupta, 2013)。例如，与PAS36亲缘关系较近的三色链霉菌Streptomycestricolor，有报道称其具有较强的抗真菌活性(Rehanetal., 2021)；加利利链霉菌Streptomycesgalilaeus能够产生阿克拉霉素类的抗肿瘤抗生素(Grocholskietal., 2019)；在紫红链霉菌Streptomyyceviolaceoruber的代谢产物中发现了具有抗菌、抗肿瘤等活性的天然化合物(Wenzeletal., 2000; Maetal., 2017)；变铅青链霉菌Streptomyceslividans是一类用于生物活性研究的模式菌株，其基因序列包含了25个功能基因簇，已从其次生代谢产物中发现了放线菌素和十一烷基灵菌红素等多种高效抗生素(Ahmedetal., 2020)。上述链霉菌表现出极大的研发潜力，后续课题组也将采用生物活性追踪和现代分离纯化技术，对本实验分离鉴定的抗菌活性菌株进行次生代谢产物及其作用机制研究。

总之，本研究以恶劣环境下生存的美洲大蠊为研究材料，以6种人体病原细菌为指示菌株，筛选出34株具有不同程度抗菌活性的肠道共生放线菌，为后续挖掘新型高效抗生素提供了重要的微生物资源。