川崎病表观遗传学研究进展

王琛玥，焦富勇，冯建英

(陕西省川崎病诊疗中心 陕西省人民医院儿童病院 西安交通大学第三附属医院儿科，陕西 西安 710068)

川崎病(Kawasaki disease，KD)，又被称为皮肤黏膜淋巴结综合征，是由日本医生川崎富作(Dr.Tomisaku Kawasaki)于1967年首次报道，主要的临床表现为超过5天的持续性发热、黏膜改变、皮疹、颈部淋巴结非化脓性肿大、双侧球结膜充血、手足硬性水肿及指趾末端脱皮等[1]。KD主要发生在5岁以下儿童，且具有较明显的性别及地域差异，男性多于女性，亚裔儿童发病率高于欧洲和北美国家[1]。日本针对全国川崎病进行流行病学调查，结果显示2015—2016年5岁以下儿童川崎病的发病率为(309.0～330.2)/10万[2]；韩国调查结果显示，2014年5岁以下儿童川崎病的发病率为194.7/10万[3]。我国尚未发现较新的、全国范围内的发病率数据，北京市调查结果显示2000—2004年5岁以下儿童川崎病的发病率为(40.9～55.1)/10万，上海市2008—2012年5岁以下儿童川崎病的发病率为(30.3～71.9)/10万[4]。KD主要的病理改变是非特异性血管炎，累及全身中小血管，尤以冠状动脉为主。KD目前的标准治疗方案为丙种球蛋白联合阿司匹林，虽然可以降低冠状动脉瘤的发生率，但仍存在冠状动脉损伤(coronary arteries abnormalities，CAAs)[5]。

近年来，国内外的研究发现，KD发病与外源性感染、遗传易感性及免疫反应显著相关。流行病学和临床报告表明，KD可由链球菌、金黄色葡萄球菌、支原体、衣原体、麻疹病毒、博卡病毒、鼻病毒、轮状病毒、腺病毒、细小病毒B19、真菌等诱发[6]。KD的易感性与遗传因素密切相关。表观遗传学(epigenetics)在基因遗传、环境因素相互影响疾病中的作用已被广泛探索[7]。Waddington于1942年首先提出表观遗传学的概念，它是研究基因型如何产生表型的过程，是在不改变基因序列的前提下，通过DNA和组蛋白化学修饰、RNA干扰、染色质重塑等多种机制影响和调节基因的功能及相关特性，决定基因的表达方式，并可以通过细胞分裂和增殖周期进行遗传[8]。目前国内外针对表观遗传学的研究主要集中在基因表达变化的调控机制方面。有学者表明，表观遗传调控及功能障碍在生理疾病中的重要性日益增加，其在风湿免疫疾病、肿瘤、心血管病等多种疾病的发生发展中作用显著[9-12]。近年来，有学者对参与KD发病机制的基因表观遗传调控进行了相关研究，表观遗传修饰可以通过几种方式发生，包括胞嘧啶的共价修饰(如DNA甲基转移酶的甲基化)、组蛋白的转录后修饰(如乙酰化、磷酸化、甲基化、瓜氨酸化、泛素化、核糖化和亚基化)及基于RNA的转录机制的调节[13]。本文重点阐述KD相关的表观遗传学研究，进而为KD的发病机制、早期识别、生物标志物、新型治疗等方面提供新的思路。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，是最早发现的、目前最典型的表观遗传学修饰，其在维持细胞生理结构功能、遗传因子和相关疾病发生发展中发挥着重要作用，是KD中研究最广泛的表观遗传学修饰。DNA甲基化是由一组DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)和其他辅助蛋白来调控，是在DNMTs的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(sadenosylmethionine，SAM)作为甲基供体，与胞嘧啶的C5位结合形成5-甲基胞嘧啶(5-methylCytosine，5mC)的化学修饰过程[13]。这种修饰反应主要发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(Cytidine-phosphatte-Guanonine oligodeoxynucleotides，CpG)位点上。管家基因的启动子、部分外显子及内含子富含CpG的区域，被称为CpG岛。在全基因组中，CpG岛通常位于基因的启动子区域[14]。甲基与基因组的CpG岛的共价结合可以在不改变基因序列基础上调节基因的表达，从而影响蛋白质的表达。DNMTs家族系包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT3L-AS1，DNMT1不仅能维持DNA甲基化水平，而且对T淋巴细胞分化的表达起重要作用，DNMT3A和DNMT3B主要功能为起始甲基化[15]，其表观遗传学的改变在免疫性疾病发生发展中起着重要的作用。在人类基因组中，甲基化的基因通常与转录活跃的基因相关，启动子区域中CpG岛的超甲基化可通过募集转录阻遏物或掩盖转录激活因子的结合而导致长期稳定的基因抑制[16]。在全基因组或单个基因水平方面，DNA甲基化的动态变化对于正常发育和疾病中的细胞分化作用至关重要。

Huang等[17]对KD的基因组DNA甲基化和基因表达进行了分析，发现KD患者的DNMT1和DNMT3A的表达水平明显低于正常对照组，短暂的DNA甲基化过程发生在KD的急性阶段。Li等[18]对KD患者免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIg)给药前后DNA甲基化的变化进行了研究，证明用IVIg治疗主要通过减少甲基化CpG标记物来改变DNA甲基化，抑制免疫炎症反应。Chen等[19]发现KD患者与正常对照组二者的CpG区域甲基化具有明显差异，不同的甲基化区域包含了参与炎症反应、先天免疫和趋化因子信号途径的基因。在基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)、toll-样受体(toll-like receptors，TLRs)、NOD样受体(NOD-likereceptors,NLRs)、IgG的Fc组分低亲和性IIa受体(Fc fragment of IgG,low affinity IIa receptor，FCGR2A)等基因中可以观察到KD相关的表观遗传改变，为KD的病理生理学提供了新的依据。

TLRs不仅能激活人体天然免疫系统而且能调节获得性免疫反应，与免疫性疾病及炎性疾病密切相关。TLRs广泛识别细菌(脂多糖)和病毒(dsDNA/RNA、ssDNA/RNA)上所存在的特征模式分子，通过激活蛋白激酶(如IRAK1/4、TBK和IKKi等)介导炎症反应和细胞因子的生物合成。除KD急性期的TLR3和TLR7外，KD患者TLRs的mRNA表达都有所升高。然而，与正常对照组相比，KD患者急性期TLR1、2、4、6、8、9上的甲基化模式分子表达水平较低。在IVIg治疗后，此差异更显著[20]。已有研究证明，用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激TLR2和TLR4可以调节KD小鼠模型中的IL-2、IL-6、IL-10、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和干扰素-β(interferon-beta，INF-β)的表达，这一观察结果提供了KD是由细菌感染触发的相关证据[21]。

在KD急性期，巨噬细胞从M1到M2的活化已有所研究。近年来，使用基因芯片阵列对急性KD患者的转录组进行分析，除了与M2巨噬细胞相关的标记物外，TLR2和IL2RA(M1巨噬细胞)的表达有所升高(例如MS4A4A、MS4A6A、TLR1、TLR8、TLR5、CD36、CCR2和ARG1)。这些基因的启动子区域处于低甲基化状态。对KD患者进行的IVIg治疗通过丰富低甲基化状态，进一步增强了这些基因的表达模式。中性粒细胞激活异常也与KD有关。在KD患者中观察到具有异常甲基化模式的中性粒细胞激活标记CD177表达增强。与IVIg敏感KD患者组的CD177水平相比，IVIg耐药KD患者组的CD177水平相对较高[22]。

免疫细胞中的Fc受体[免疫受体酪氨酸基激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)相关受体家族]可与抗体或抗原抗体复合物结合，帮助调理吞噬、脱粒和细胞因子生物合成[23]。近年来，研究发现Fc受体的表达水平及其功能的改变与风湿免疫疾病发生有关[24]。全基因组关研究(genome-wide association study，GWAS)已证实FCGR2A基因是KD的易感性基因。FCGR2A主要编码在激活的免疫细胞中广泛表达的免疫球蛋白IgG(Fc区域受体II-a)受体。研究表明，该基因的甲基化水平会影响IgG2与其受体的结合。一项最新的GWAS研究发现，与对照组相比，KD患者的FCGR2A基因具有15.54%低甲基化模式的表观遗传调控。与IVIg敏感的KD患者相比，IVIg耐药患者的低甲基化水平也显著较高[25]。

2 microRNA

microRNAs(miRNAs)是内源性，单链非编码小RNAs(长约18～25个核苷酸)，在控制mRNA翻译中发挥着重要作用。非编码的RNA被转录但不转化为蛋白质，而是作为一种表观遗传机制来调控基因表达。它们可以调节转录后的基因表达，具有抑制靶mRNA转录、翻译或者能够剪切靶mRNA并促进其降解的功能[26]。多数miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性。miRNA的表达受表观遗传机制控制，其本身也控制着表观遗传机制，组成一个“表观遗传学-miRNA调控回路”，其调控环节的异常与多种疾病相关[27]。

miRNA具有独特的表达模式，因此被用作疾病诊断的新型非侵入性生物标志物[28]。有报道称miRNAs可在外周血中被释放，这些miRNA与某些特定的病理生理状态相关。因此，外周血清miRNA被广泛用作各种疾病的诊断和治疗性生物标记物。据报道，异常的miRNAs表达与免疫性疾病、心血管疾病、炎症和肿瘤密切相关，在KD的发病机制中也起着重要作用。研究表明，在KD的急性期，miR-143、miR-199b-5p、miR-618、miR-223和miR-145的表达明显较高[29]。另一项研究表明，在KD患者中，血清miR-200c和miR-371-5p水平明显高于健康对照组。这些miRNAs可能在KD的发病机制中发挥重要作用，并可作为KD的潜在生物标志物[30]。已有学者研究了血清miRNA，如miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p在KD中作为生物标记物的作用[31]。Zhang等[32]对102例KD患者进行研究，血清中miR-200c和miR-371-5p在KD急性期显著升高；在IVIg耐药的KD患者中，其水平也较高；研究还表明，经过治疗后，其水平较前下降。在一项研究中显示，血浆miR-328、miR-575、miR-134和miR-671-5p已被证明是诊断KD和通过影响炎症基因表达来预测IVIg治疗结果的潜在生物标志物。Wang等[33]研究显示在KD中，hsa-let-7b-5p和hsa-miR-223-3p略有下调，而miR-200c、miR-197-3p和miR-671-5p水平有所上调。Li等[34]研究表明，与健康对照组相比，KD患者的血浆中的18个miRNA表达具有差异；miR-125a-5p在KD患者血浆中显著增加，其通过调节靶基因MKK7诱导血管内皮细胞凋亡，在KD的发病机制中发挥作用。

3 长链非编码RNA

长链非编码RNAs(lncRNAs)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA分子，通过调节基因转录参与细胞内多种过程的调控。在人类基因组中已经发现了超过27 000个lncRNAs，有新研究证明它们的功能与人类疾病的发展具有密切相关性[35]。Ko等[36]研究了37例KD患者lncRNA表达的变化，结果显示，XLOC_006277的转录在IVIg敏感的KD患者中，急性期表现过高，IVIg治疗后下降；在之后发展为CAAs的KD患者中也发现了更高水平的XLOC_006277转录。

研究发现lncRNA可以通过增加促炎细胞因子及其他炎症靶基因的转录或增强炎症信号来加强炎症反应。THRIL(TNF-和hnRNPL相关的免疫调节性lncRNA)是TLR2激活后诱导的许多lncRNA之一。CXCL10是目前已被发现的由THRIL调节的基因之一，在KD患者急性期水平上调，已被证实为KD的生物标志物[37]。在一项17例KD患者的研究中发现，在KD急性期，当TNF-α水平升高时，linc1992/thirl表达较低，故linc1992/thril被认为可能是KD免疫激活的一种新的生物标志物。

lncRNAs在炎症反应时被诱导表达，并在炎症反应过程中调节基因转录。目前有关KD与lncRNAs的研究较少，但研究已经表明KD与lncRNAs表达的变化密切相关。在深入了解lncRNAs在KD中的生物学功能和作用方面，仍需更多的研究，以发现更多的生物标志物及探索新的治疗方案，

综上所述，KD作为儿童较为常见的免疫炎症性疾病，常伴冠状动脉损害，甚至发生冠状动脉瘤破裂、心肌梗死及猝死等严重并发症，其影响患儿正常生长发育，并给患儿家庭带来较沉重的心理和经济负担。故减少KD发生、控制其发展尤为重要。KD受遗传及环境双重控制，外界环境的变化密切影响着KD的发生发展，故需在表观遗传学方面对本病做进一步研究。

目前关于KD中表观遗传学的研究及认知处于初步阶段，本文阐述了几种关于KD诊断和疾病预测的新的生物标志物，其中大多数研究是基于有限患者数量的单中心研究，还需更大的样本量来进行验证。表观遗传学作为基因调控的开关，对表观遗传学调控机制进行相关的研究，可以为KD的发病机制、早期识别、生物标志物、新型治疗等方面提供新的思路。