牛病毒性腹泻-黏膜病研究进展

2022-12-28杨显超杨德全陶田谷晟鞠厚斌王建赵洪进

中国奶牛 2022年1期

杨显超，杨德全，陶田谷晟，鞠厚斌，王建，赵洪进

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease, BVD/MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）引起的一种以腹泻、胃肠炎、消化道黏膜腐烂和坏死为特征的持续性、接触性的传染病。该病在世界流行广泛，已经对全球养牛业造成严重危害，被世界动物卫生组织列为必须上报的疫病。目前，我国的BVD流行范围广且日益严重、流行毒株基因型众多，流行特点及流行趋势不断出现新特点，危害十分严重，对BVD的防控提出了新的挑战。本文就BVDV的基因分型、流行情况、诊断方法和防控策略等方面作一综述，以期为BVD的防控工作提供新思路、新对策。

1 牛病毒性腹泻病毒的基因分型

BVDV基因分型是追踪BVDV传播、变异以及持续感染等极为有效的方法，对了解病毒起源、分布和流行具有重要意义。根据基因组5’UTR的差异，BVDV可分为BVDV1型和BVDV2型两种基因型[1]。到目前为止，BVDV1型已被分为22个基因亚型(1a～1v)[2]。我国已有多种亚型的报道，2006年确定了猪源ZM-95株为1m亚型[3]；2013年兰州兽医研究所首次报道了我国西部地区存在BVDV1q亚型[4]；2015年我国学者调查表明BVDV1m亚型为国内主要流行毒株，其次为1b和1u亚型，其中1u为国内首次确认存在的新基因亚型[5]。国内学者朱远茂等[6]对分离到的一株BVDV毒株LJ36/14首次定型为BVDV1v亚型。BVDV2型分为BVDV2a、2b、2c和2d4个亚型[7]。Ridpath等[8]于2010年建议将BVDV2型分为2个亚型，即2a和2b。任敏等[9]、李庆超等[10]在山东、新疆和吉林均分离到BVDV2a亚型毒株，王炜等[11]于2014年在山东分离到BVDV2b亚型毒株。可见，国内BVDV流行毒株基因亚型复杂多样。

2 牛病毒性腹泻病毒的流行状况

BVDV于1946年首次在北美洲发现，现呈全球性分布，给养牛业造成巨大的经济损失。根据许多国家血清流行病学调查结果显示[12]：美国牛血清样品BVDV阳性率为50%，澳大利亚为89%，智利、乌拉圭、秘鲁、巴西、阿根廷及哥伦比亚等南美国家平均阳性率高达85%。我国于1980年首次在吉林省发现该病毒[13]，此后，陈永僩等[14]在北京和四川省送检的奶牛和牦牛血清样品中首次检测到BVDV的中和抗体，从血清学上证实了我国有BVDV感染的存在。随后许多学者[15～22]对国内多个省区进行了BVDV的流行病学调查，调查结果表明，天津、陕西、甘肃、宁夏、青海、安徽、江苏、广西、黑龙江、重庆、新疆、山西、山东、河南、河北、吉林、湖北、内蒙古、辽宁、江苏、西藏和福建等20多个省区市均有本病的发生。流行病学调查表明，各地区存在不同程度的感染，且有逐年升高的态势[18]，而且一些地区感染相当严重[20,23]。国内学者Ran等[24]检索国内2003年3月-2018年3月关于奶牛BVDV发病率和流行率的论文数据，运用meta分析法进行系统的回顾和评价，结果表明我国奶牛BVDV的总阳性率为53.0%（95% CI 40.2～65.7），其中福建省奶牛群BVDV阳性率最高达90.0%，其次为陕西省（88.9%）和山东省（83.3%）。同时也证实了在过去的十年里国内奶牛BVDV的感染呈不断扩大并广泛传播的趋势。

3 诊断方法

通过流行病学调查、临床症状和特征性病理变化等可作初步的诊断。如需进一步诊断，须经实验室确诊。

3.1 病毒分离

牛肾、脾和睾丸等多种牛源细胞均可用于BVDV的分离。李佑民等[13]在上世纪80年代用初生牛肾原代和次代细胞从流产胎儿脾脏中首次分离到该病毒。1983年，有学者用犊牛肾或睾丸细胞分离到一株BVDV。1986年中国兽药监察所用牛肾传代细胞也分离到该病毒。如今，牛肾细胞已成为分离BVDV最常用的细胞。但这种方法对试验条件要求比较高，不适于大规模的病毒检测和流行病学调查，只适用于致细胞病变型的BVDV的分离鉴定。

3.2 血清学检查

3.2.1 免疫琼脂扩散试验

免疫琼脂扩散试验因操作简单易行，在基层兽医应用比较广泛。但其不具备株特异性，准确率不高，易造成漏检。

3.3.2 病毒中和试验

病毒中和试验为国际贸易指定试验，也是BVDV检测的金标准。该方法可定性定量检测，敏感性较琼脂扩散试验高，重复率好，适用于BVDV疫苗免疫效果评估和血清流行病学调查评估。但是，由于该方法试验操作复杂且耗时，还容易受到各种因素干扰，目前已经不经常使用。

3.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附方法(ELISA)包括检测抗体的间接ELISA和检测抗原的抗原捕获ELISA，具有操作简便、快速、通量高、易于标准化等优点，可广泛用于BVDV的抗体检测和流行病学调查。高欲燃建立了间接ELISA方法用于检测血清中BVDV E2蛋白抗体，与中和试验的符合率非常好，适合大量血清样品的高通量检测[25]。范晴等[26]建立了检测BVDV抗原的捕获ELISA方法，与RT-PCR的符合率为100%，可用于BVDV抗原的检测。

3.3 分子生物学检测

3.3.1 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

根据已知的BVDV的保守基因序列设计引物，RTPCR可高度灵敏、特异快速地检测病毒RNA；或利用不同基因型中保守序列的差异分别设计引物，对BVDV进行基因分型。王伟利等[27]根据BVDV 5’UTR保守序列设计特异性引物用于建立检测BVDV的RT-PCR方法，结果显示与病毒分离试验的符合率达100%。根据BVDV1型和BVDV2型5’UTR序列的差异，分别设计特异性引物，建立可同时检测BVDV1型和BVDV2型的RT-PCR方法，可用于BVDV的快速分型检测[28]。

3.3.2 实时荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR检测方法与RT-PCR检测方法相比，具有特异性高、敏感性强、快速和重复性好等优点，可以对BVDV进行早期诊断，及时发现病源，且可以实现快速、准确检测。陈其兵等[29]根据BVDV 5’UTR保守序列设计特异性引物和探针，优化建立了荧光定量RT-PCR检测方法。

3.3.3 荧光环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）

荧光环介导逆转录等温扩增技术用于BVDV的检测，灵敏度高、特异性好，且具有成本低、快速的优点，尤其适用于现场检测，为BVDV的检测提供了新的技术方法，对BVDV的有效防制具有重要意义。国内学者根据BVDV 5’UTR保守序列设计了多条特异性引物，建立了BVDV的RT-LAMP快速检测方法[30,31]，为该病的检测增添了光彩。

4 防控措施

流行性腹泻是世界养牛业的一种重要疫病，给全球养牛业造成巨大的经济损失。因此，很多发达国家非常重视本病的防控和净化。目前，发达国家对BVD的防控策略主要分为两种：一种是不使用疫苗的“筛查-淘汰”策略，这一策略需要严格的生物安全管理，适合低密度养牛地区，已在北欧的瑞典、挪威等一些国家取得了成功。另一种是使用疫苗的“免疫-淘汰”策略，适合高密度养牛地区，已在美国和德国取得成功。借鉴发达国家防控BVD的成功经验，制定符合我国国情的防控策略，已成为控制BVD的当务之急。基于我国目前BVDV的感染状态，“免疫-淘汰”策略更适合我国当前牛场的BVDV控制[32]。