全自动在线顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用检测水样中24 种常见农药

俞嘉斌, 邹 波, 魏春明, 赵 鹏, 董林沛,吴小军, 宋祥瑞, 杨瑞琴, 张云峰*,

(1. 中国人民公安大学 侦查学院，北京 100038；2. 公安部物证鉴定中心，北京 100038)

农药在实际应用过程中，对水体及土壤等环境存在一定的污染风险[1]。同时由于农药容易获得，还常被不法分子用于实施投毒犯罪[2]。因此，研究和建立环境基质尤其是水样中农药的快速高效分析方法，是维护农产品和环境安全、保障生产生活秩序及打击相关犯罪的迫切要求。

目前，对于水基质中农药检测常见的前处理方法有固相萃取[3-4]、分散液相萃取[5]及QuEChERS[6]等，为提高灵敏度、保护仪器设备，这些方法多数还需要检测人员使用萃取剂进行提纯、浓缩等预处理，存在检材用量大、检出限过高和检测时间过长等弊端，此外，假如遇到浑浊水样时容易造成固相萃取柱堵塞，分散液相萃取需要严格控制温度等，一定程度上影响了检测结果的准确性和检测效率。水样中农药检测常用的仪器分析方法有气相色谱法[7]、气相色谱-质谱联用 (GC/MS)法[8-11]、高效液相色谱-质谱联用法[12-15]等，其中GC/MS 在公安实战检测领域最为常见，且该方法对氨基甲酸酯类农药也有较为理想的检出效果[16]。

固相微萃取技术 (SPME) 是以液-固吸附平衡为基础，利用分析物不同组分在纤维涂层表面的亲和力差异而实现分离富集的一种方法，在兼具分析速度和效率的同时，还可最大限度降低分析成本。为了提高农药检测的灵敏度，减少有机试剂的使用，本研究建立了水中24 种常见农药的全自动在线顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC/MS) 检测技术。郭震等[17]采用手动固相微萃取进行水样的前处理，耗时长且萃取稳定性不高，而本研究采用全自动在线系统进行HSSPME 处理，可大幅缩短人工前处理时间，提高萃取目标农药的稳定性。此外，现有文献中鲜有对萃取温度和时间进行综合优化的，多采用单变量考察[18-20]，而本研究综合动力学和热力学因素对萃取温度和时间进行多变量综合考察，进一步优化了萃取效果。所建立方法灵敏度高、精密度较好，为农药投毒、中毒案件的侦办和相关物证检验检测提供了新的技术路线。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 气相色谱-质谱联用仪：GC/MS-QP2010 Ultra，日本Shimadzu 公司；色谱柱：DB-5 ms(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)，美国Agilent 公司；全自动多功能自动进样系统：PAL RTC 型 (带HSSPME 模块)，瑞士CTC Analytics 有限公司；萃取针：PAL SPME Fibers (100 μm PDMS，85 μm Polyacrylate，95 μm Carbon WR/PDMS)，瑞士CTC Analytics 有限公司；Milli-Q Direct 纯水系统，德国Merck Millipore 公司；Fresco21 型离心机，美国Thermo Fisher Scientific 公司；W880 真空离心浓缩仪，北京吉艾姆科技有限公司。

1.1.2 药剂及试剂

氨基甲酸酯类杀虫剂：克百威 (carbofuran)、甲萘威 (carbaryl)、残杀威 (propoxur)、异丙威(isoprocarb)、抗蚜威 (pirimicarb) 及仲丁威(fenobucarb)。

有机氯类杀虫剂 (预试验发现，六六六及硫丹两种农药各自的不同构型间由于结构相近、化学性质相似，具有相似的萃取及分析结果，故本研究选取在公安实践案件中最常见的两种有机氯杀虫剂构型作为研究代表)：α-六六六 (α-BHC) 和β-硫丹 (β-endosulfan)。

除草剂类：莠去津 (atrazine)、西草净 (simetryn)、二甲戊灵 (pendimethalin) 及2,4-滴丁酯 (2,4-D butylate)。

有机磷类杀虫剂：甲拌磷 (phorate)、敌敌畏(dichlorvos)、治螟磷 (sulfotep)、对硫磷 (parathion)、内吸磷 (demeton)、二嗪磷 (diazinon) 及氯唑磷(isazofos)。

拟除虫菊酯类杀虫剂：联苯菊酯 (bifenthrin)、甲氰菊酯 (fenpropathrin)、反式氯菊酯 (transpermethrin)、四氟苯菊酯 (transfluthrin) 及苄呋菊酯 (resmethrin)。

以上共计24 种农药标准品溶液均由中国Alta Scientific 有限公司提供，质量浓度为1.0 mg/mL；甲醇及NaCl 为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制 分别将1.0 mg/mL 的24 种农药标准品用甲醇溶液配制成100 μg/mL 的单一标准储备液，于-20 ℃保存，备用。分别取1 mL上述单一标准储备液，混合，用甲醇稀释，配制成1.0 μg/mL 的混合标准工作溶液，于-20 ℃保存，备用。

1.2.2 液-液萃取步骤 取1 mL 待检水样于5 mL的离心管中，加入2 mL 乙酸乙酯，振摇10 min后涡旋离心15 min；取上清液浓缩至干，加入0.4 mL 甲醇复溶，待GC/MS 分析 (公安鉴定领域为方便与液相色谱方法进行比较，常统一使用甲醇作为溶剂进行GC/MS 分析，且24 种目标农药在甲醇中均具有较好的溶解性，故本研究选用甲醇作为复溶溶剂，通过分流进样的方式以减少分析中柱流失的影响)。

1.2.3 顶空固相微萃取条件 PAL RTC 型全自动在线进样系统SPME 模块参数：萃取温度60 ℃，萃取时间45 min，孵化时间10 min，振摇速率250 r/min，进样口解析时间3 min。

1.2.4 GC/MS 条件

色谱条件：DB-5 ms (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)毛细管色谱柱；载气为高纯氦气 (99.999%)，恒流模式，柱流量1.56 mL/min；不分流进样，进样口温度260 ℃。升温程序为：初始温度80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 速率升至280 ℃，保持8 min，总时长30 min。

质谱条件：电喷雾电离源 (EI)，离子源温度200 ℃，接口温度200 ℃，碰撞能量70 eV。采用全扫描 (SCAN) 和选择离子监测 (SIM) 两种质谱扫描模式，SCAN 模式扫描范围m/z40～450，确定农药扫描离子、保留时间以及有无基质干扰，SIM 模式下24 种目标农药质谱参数详见表1。

表1 待测24 种目标农药的保留时间和质谱参数Table 1 Retention time and mass spectrometry parameters of twenty-four pesticides

2 结果与讨论

2.1 萃取条件优化

为确定最优分析条件，根据同类农药具有相似化学性质和色谱行为这一前提，选取9 种代表性农药进行萃取条件优化试验，以建立优化的萃取方法。其中，敌敌畏和甲拌磷代表有机磷类，克百威和甲萘威代表氨基甲酸酯类，甲氰菊酯和反式氯菊酯代表拟除虫菊酯类，α-六六六和β-硫丹代表有机氯类，莠去津代表除草剂类。

2.1.1 萃取涂层材料选择 由于目标物的萃取效率在很大程度上取决于被分析物与纤维涂层的亲和性。因此，萃取纤维材料的选择是整个固相萃取过程中最为关键的步骤。本研究选择聚二甲硅氧烷 (PDMS)、聚丙烯酸酯 (PA) 和碳填充/聚二甲硅氧烷混合材料 (CWR/PDMS) 3 种商用纤维材料进行萃取效果比较试验。分别配制质量浓度为100 μg/L 的9 种代表性农药标准工作溶液，取2 mL 于20 mL 的顶空瓶中，在萃取温度60 ℃下，分别采用以上3 种材料萃取30 min，通过比较各农药特征离子峰面积的大小，确定最佳萃取材料。结果 (图1) 显示，以PDMS (100 μm) 作为检测9 种农药的萃取涂层材料时萃取效果最佳。

图1 不同萃取涂层材料对萃取效率的影响Fig.1 Effect of different extraction coating materials on extraction efficiency

2.1.2 萃取温度及萃取时间优化 萃取温度和萃取时间是影响萃取效果的两个关键因素[21-23]，本研究综合考察了这两个因素对萃取效果的影响。配制50 μg/L 的 9 种代表性农药标准工作溶液，分别取2 mL 于20 mL 的顶空瓶中，依次设置15、30、45、60 和75 min 梯度萃取时间，在40、60 和80 ℃温度下萃取，根据农药特征离子峰面积，构建出综合考察萃取温度和萃取时间的可视化响应面。结果显示：当萃取温度升高，甲拌磷和克百威萃取达到平衡所需的时间显著缩短，但同时也会对目标物在萃取纤维表面和空气间的分配系数产生负面影响，由于萃取动力学和热力学的共同作用，当高温和低温体系均萃取足够长时间达到平衡状态时，高温体系的萃取量却明显少于低温体系。因此，实践中是否选择加热萃取，需要在缩短分析时间和提高灵敏度之间依据实际情况综合比较，合理抉择。

此外，在低温条件下，甲氰菊酯和反式氯菊酯的萃取效果不佳，即使增加萃取时间，萃取量的提升也不明显，而随着萃取温度升高，其萃取量有明显提升。这种现象可能是由于菊酯类农药相对分子量大、沸点高造成的。而甲萘威和敌敌畏对高温均比较敏感，在60 和80 ℃条件下，若萃取平衡后继续延长萃取时间，萃取量会出现明显下降趋势，这可能与农药的稳定性及农药与PDMS萃取材料的亲和性相关。进一步结合α-六六六、莠去津和β-硫丹的可视化曲面分析，本方法优化后的萃取温度为60 ℃、萃取时间为45 min。结果见图2。

图2 各农药随萃取时间和萃取温度变化的响应面反映Fig.2 Response surface reflection of pesticides with different extraction time and extraction temperature

2.1.3 离子浓度选择 根据理论研究，提高基质中离子浓度可以增大农药在萃取涂层与基质间的分配系数[24]，从而改善检测的灵敏度，其中向基质中加盐是最简单高效的方法。配制100 μg/L 的9 种农药标准工作溶液，取2 mL 于20 mL 的顶空瓶中，在不加NaCl 和加入NaCl 至饱和的不同离子浓度条件下，测试PDMS (100 μm) 萃取纤维对各目标农药的萃取效果。保持其他萃取条件 (萃取温度45 ℃，萃取时间45 min) 一致，分别比较目标农药在不同离子浓度下特征离子峰面积的变化。结果 (图3) 显示，加入NaCl 后，目标农药的萃取效率均有不同程度的提升，因此在后续研究中，均选择向水样中添加NaCl 至饱和状态。

图3 基质离子浓度对萃取效率的影响Fig.3 Effect of matrix ion concentration on extraction efficiency

2.1.4 进样口解吸时间优化 萃取流程完成后，包裹SPME 纤维的萃取针会随自动进样系统立即插入气相色谱进样口进行解吸附。研究中发现，增加解吸时间能使分析物从纤维上解吸更完全，但也会造成纤维材料本身的流失，影响纤维涂层的使用寿命和分析结果。因此，本研究预先考察了240、250 和260 ℃不同解析温度对萃取效果的影响，结果显示各农药特征离子峰面积无明显变化。在此基础上，将萃取后的2 mL 200 μg/L 的9 种农药标准工作溶液在260 ℃下分别解析1、2 和3 min，以各农药的特征离子峰面积作为测评依据，考察检出效果。结果 (图4) 显示，随着解析时间的延长，敌敌畏、β-硫丹和莠去津3 种农药的响应值提升明显，而其余6 种农药均可在较短的时间内完成解吸。为达到最佳的分析结果，本研究确定最优解吸时间为3 min。

图4 进样口解析时间对萃取效率的影响Fig.4 Effect of desorption time on extraction efficiency

2.2 HS-SPME-GC/MS 对24 种农药的检测结果

采用上述优化后的萃取条件萃取后，通过HS-SPME-GC/MS 方法对24 种目标农药进行分析，其总离子流色谱如图5 所示，各组分均有效分离且响应良好。

图5 总离子流色谱图Fig.5 Total ion flow chromatogram

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系、线性范围及检出限、定量限 在上述优化后的萃取条件下，对24 种目标农药的HSSPME-GC/MS 分析结果参数进行考察，采用目标物特征离子峰面积 (y) 对标准工作溶液进样质量浓度 (x) 进行线性拟合，决定系数 (R2) 均大于0.995 0。24 种农药的检出限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 分别在0.25～5.0 μg/L 和0.5～10 μg/L 之间 (表2)。

表2 24 种目标农药的线性关系、检出限和定量限Table 2 Results of linearities, LODs and LOQs of twenty-four pesticides

2.3.2 正确度 向空白水基质中分别添加10、50和100 μg/L 3 个水平的各目标农药混合标准工作溶液，按照上述优化后的条件进行前处理和检测，每个添加水平平行测定6 次，结果见表3。24 种目标农药的回收率在86%～117%之间，在3 个添加水平下的日内及日间相对标准偏差 (RSD) 均小于18%。

表3 24 种目标农药的添加回收率及相对标准偏差 (n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of twenty-four pesticides (n=6)

2.4 方法比较

为验证本方法的适应性和高灵敏度优势，将本方法与传统液-液萃取前处理方法进行了对比，结果见表4。在添加水平为100 μg/L 时，本方法中农药的回收率均大于86%，而传统液-液萃取方法中24 种农药的回收率均小于85%。与传统液-液萃取[25]直接进样的GC/MS 分析方法相比，HSSPME-GC/MS 方法的检测灵敏度明显提高，并在缩短前处理时间的同时还可最大限度减少有毒萃取溶剂的使用；与QuEChERS-GC/MS 分析方法[26]相比，本方法中农药的检出限及线性范围也有所改善，但由于多目标物共萃取时产生的竞争吸附现象可能会导致方法定量误差，因此需通过研发高兼容性的萃取材料加以改善。与传统浸入式固相微萃取 (DI-SPME) 的农药前处理方法[17]相比，全自动在线HS-SPME 可极大程度减少人为误差，同时提高农药的回收率，并且相较于正交试验或针对单一变量考察萃取时间/萃取温度的方法，本研究中兼顾萃取动力学和热力学的考察方式更为精确，能够得到更佳的萃取效果。

表4 在线HS-SPME 与传统液-液萃取方法在回收率分布、有机溶剂使用及耗时方面的对比Table 4 Comparison of the range of recovery, the amount of organic reagent and the consumed time between online HS-SPME and traditional liquid-liquid extraction method

2.5 实际案例应用

2021 年4 月2 日，公安部物证鉴定中心受理了内蒙古鄂尔多斯地区一起鱼塘水投毒案件，杨某某报案称自家鱼塘被人投毒，导致鱼苗大面积死亡。案件受理后，采用本研究建立的方法对送检的鱼塘水样本进行检验，从中检出了氨基甲酸酯类农药仲丁威，整个检验过程为全自动一体化操作，总耗时1.6 h 左右，检测结果如图6 所示。本研究所建立的分析方法无需人工使用有机溶剂对样品进行萃取，大大节约了案件物证的检验时间，能够满足公安机关对鱼塘等水域投毒案件水样中农药检验鉴定的需求。

图6 鱼塘水检材色谱图Fig.6 Chromatogram of fish pond water sample

3 结论

本研究建立了水中常见24 种农药的HS-SPMEGC/MS 检测方法。相较于传统检测方法，本方法的灵敏度和分析速度均有较大程度提升，通过对主要萃取条件进行优化，对萃取温度和萃取时间两方面条件综合进行考察，确定了最优的萃取条件：选用PDMS 萃取材料，添加NaCl 至饱和提升萃取基质中离子浓度，萃取温度260 ℃，萃取时间45 min，进样口解析时间3 min。本研究所建立的方法所需样品量少 (2 mL)，且无需使用有机萃取溶剂，兼具有环保和安全的应用优势。同时，本方法采用全自动在线固相微萃取这一前处理技术，最大限度减少了人工操作带来的偶然误差，提高了检测结果的客观性和准确性。在同时检测多个样品时，萃取步骤和仪器分析能够同步进行，可有效压缩样品分析总时间，提高检验效率。在后续研究中，还将继续探究血液、尿液、脏器组织等复杂生物基质中农药的在线HS-SPMEGC/MS 分析方法，以期为公安机关毒物检验鉴定提供更优的技术方案。