超高效液相色谱-串联质谱同时检测水稻中3 种农药及2 种代谢物残留

张斌斌, 董丰收, 潘兴鲁, 吴小虎, 徐 军, 郑永权

(中国农业科学院 植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

水稻在生产过程中，病虫害发生严重，如稻瘟病、水稻纹枯病、稻飞虱、稻纵卷叶螟和二化螟等，严重影响水稻产量及质量[1-2]。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 (emamectin benzoate，以下简称甲维盐，图式1) 是高效低毒的半合成生物源杀虫剂，对双翅目、鳞翅目害虫具有优异的防治效果，是稻田使用的主要杀虫剂品种之一，可防治稻纵卷叶螟、二化螟、灰飞虱等害虫[3-4]。氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole，图式1) 是高效广谱的新一代双酰胺类杀虫剂，对鳞翅目害虫具有较高的防效，通过作用于昆虫鱼尼丁受体，使得细胞钙库中的钙离子过度释放，致使昆虫瘫痪死亡，是水稻田使用中位居前十的杀虫剂[4-5]。甲维盐和氯虫苯甲酰胺混配可延缓抗性，具有广阔的应用前景[4]。氟唑菌酰胺 (fluxapyroxad，图式1) 属于琥珀酸脱氢酶类杀菌剂，作用于病原菌蛋白复合体Ⅱ，干扰其氧化呼吸链的电子传递，进而抑制病原菌生长，对水稻纹枯病等真菌病害具有良好的防治效果，其在植物中的主要代谢物为M700F008和M700F048 (图式1)[6-7]。农药的使用使得水稻病虫害得到有效控制，保证了水稻的产量和品质，但随着农药的大量使用，其残留问题也引起社会的广泛关注。而水稻基质种类较多，除了可食用的糙米外，稻壳和稻秆还是重要的饲料原料，因而亟需建立一种方便、快捷且适用范围广的方法，检测这些农药及其代谢物。中国GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定，甲维盐在糙米上的最大残留限量 (MRL) 为0.02 mg/kg，氯虫苯甲酰胺在稻谷和糙米上的MRL 值为0.5 mg/kg，稻谷和糙米中氟唑菌酰胺的MRL 值分别为5 和1 mg/kg[8]。

图式1 甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺及其代谢物M700F008 及M700F048 结构式Scheme 1 The structural formula of emamectin benzoate, chlorantraniliprole, fluxapyroxad, M700F008 and M700F048

目前已有相关研究报道了水稻中甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺残留量的检测方法。如路彩红等[6]报道了氟唑菌酰胺母体在稻田中的残留行为；Dong 等[9-10]基于超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS) 结合QuEChERS 方法，建立了果蔬、稻米中同时检测氟唑菌酰胺及其代谢物的残留分析方法，但未对基质成分更为复杂的稻壳和稻秆进行检测分析。在实际生产中，水稻纹枯、稻纵卷叶螟等水稻病虫害发生时期相近，农药混合使用可同时防治多种病虫害，省时省力，已被广泛使用，但目前甲维盐、氯虫苯甲酰胺和氟唑菌酰胺在水稻上的同时检测方法还未见报道。因此，建立甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺及其代谢物的多残留分析方法对指导水稻农药安全使用和保障农产品安全具有重要意义。本研究采用QuEChERS 方法结合UPLC-MS/MS 技术，建立了同时测定水稻中甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺及其代谢物M700F008、M700F048残留量的分析方法，并对广西南宁、广东佛山及湖北鄂州3 地水稻样品进行田间农药残留监测。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(ExionLC UHPLC， SCIEX TRIPLE QUAD 4500，美国AB SCIEX 公司)；CK-2000 高通量组织研磨仪 (Thmorgan 公司)；TG16-WS 台式高速离心机(长沙湘仪离心机有限公司)；Mili-Q 超纯水仪 (美国Milipore 公司)。

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐标准品 (emamectin benzoate，纯度98.7%，Dr. Ehrenstorfer)；氯虫苯甲酰胺标准品 (chlorantraniliprole，纯度98.18%，Dr. Ehrenstorfer)；氟唑菌酰胺标准品 (fluxapyroxad，纯度99%，巴斯夫)；M700F008 标准品 (纯度99.5%，巴斯夫)；M700F048 标准品 (纯度94%，巴斯夫)；35%甲维盐 · 氯虫苯甲酰胺水分散粒剂 (河南蕴农植保科技有限公司)；200g/L 氟唑菌酰胺悬浮剂 (巴斯夫欧洲公司)。乙腈 (色谱纯)和甲酸 (北京北化精细化学品有限公司)；N-丙基乙二胺 (PSA)、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、石墨化碳黑 (GCB) 和Filter Unit 滤膜 (0.22 μm)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；乙腈、无水硫酸镁和氯化钠 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 田间试验设计

供试药剂为35%甲维盐 · 氯虫苯甲酰胺水分散粒剂 (施药剂量为有效成分31.5g/hm2) 和200 g/L 氟唑菌酰胺悬浮剂 (施药剂量为有效成分90 g/hm2)，均采用叶面喷雾施药2 次，施药间隔期为7 d。按NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》[11]设置空白对照区及试验区，每小区面积100 m2。最终残留试验于最后1 次施药后21、28 d 采集稻谷和稻秆样品，残留消解试验于最后1 次施药后2 h 及7、14、21、28、35 d 采集秸秆样品。根据采收间隔期设置多个 (最终残留试验2 个，残留消解试验6 个) 试验小区，分别施药，同时采收。广东、广西和湖北作为水稻主产区，具有高温、高湿的气候特点，病虫害发生频繁，农药使用量大，因而选择这3 个省份作为典型区域开展田间试验。分别从广西南宁、广东佛山及湖北鄂州采集施用了甲维盐 · 氯虫苯甲酰胺水分散粒剂的稻谷和稻秆样品，从广西和湖北采集施用了氟唑菌酰胺悬浮剂的稻谷和稻秆样品。稻谷进行脱粒，制备成糙米和稻壳样本，秸秆切成1 cm 以下小段，混匀，缩分，每份留样200 g。

1.3 分析方法

1.3.1 样品的提取与净化

糙米样品：称取5.0 g 粉碎的糙米样品于50 mL离心管中，加入5 mL 0.2%甲酸水溶液-乙腈，振荡10 min，于4 000 r/min下离心5 min；取1.5 mL上清液于装有150 mg MgSO4+ 25 mg C18的2 mL离心管中，涡旋1 min，于5 000 r/min 下离心5 min；取上清液过0.22 μm 有机滤膜，待测。

稻壳样品：称取2.0 g 粉碎的稻壳于50 mL 离心管中，加入5 mL 水和5 mL 0.2%甲酸水溶液-乙腈，振荡10 min，加入2 g 氯化钠，振荡5 min，于4 000 r/min 下离心5 min；取2.5 mL 上清液氮吹至近干，加入1 mL 乙腈复溶，涡旋3 min，将复溶液转移至盛有150 mg 硫酸镁 + 25 mg C18的2 mL 离心管中，涡旋1 min，于5 000 r/min 下离心5 min；取上清液过0.22 μm 有机滤膜，待测。

稻秆样品：称取2.0 g 粉碎的稻秆样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 水和10 mL 1%甲酸水溶液-乙腈，振荡10 min，加入4 g 氯化钠，振荡5 min，于4 000 r/min 下离心5 min；取5 mL 上清液氮吹至近干，加入1 mL 乙腈复溶，涡旋3 min，将复溶液转移至盛有150 mg 硫酸镁 + 50 mg PSA +10 mg GCB 的 2 mL 离心管中，涡旋1 min，于5 000 r/min 下离心 5 min；取上清液过0.22 μm 有机滤膜，待测。

1.3.2 检测条件

色谱条件： UPLC® HSS T3 色谱柱 (2.1 mm ×50 mm，1.8 μm)；流速为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；进样体积为3 μL；流动相A 为 0.2%甲酸水溶液，B 为甲醇，梯度洗脱，洗脱时间为5 min：0～0.5 min 时，10% B；＞ 0.5～1.5 min，10% B→90% B；＞1.5～3.5 min，90% B；＞ 3.5～4.5 min，90% B→10% B，＞ 4.5～5.0 min， 10% B。

质谱条件：电喷雾离子源 (ESI)；多反应监测模式 (MRM)；碰撞气为氮气；气帘气(CUR)206.85 MPa；喷撞气 (CAD) 62.055 MPa；离子化电压 5 500 V；离子源温度300 ℃；喷雾气(GS1)413.7 MPa；辅助加热气(GS2) 413.7 MPa；碰撞室入口电压(EP) 10 V；碰撞室出口电压(CXP) 6 V；其他质谱参数见表1。

表1 甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008 和M700F048 主要质谱检测参数Table 1 Mass spectrometric parameters for the detection of emamectin benzoate, chlorantraniliprole,fluxapyroxad, M700F008 and M700F048

1.4 标准曲线的绘制及添加回收试验

分别称取适量的5 种供试化合物标准品，用乙腈溶解，配制成1 000 mg/L 母液。将5 种母液等比例混合后用乙腈和基质空白 (糙米、稻壳、稻秆) 提取液稀释，分别配制成系列标准工作溶液和基质匹配标准工作溶液，分别按1.3.2 节的条件进行测定，以质量浓度 (x) 为横坐标，定量离子峰面积(y)为纵坐标绘制标准工作曲线。

分别向糙米、稻壳和稻秆空白基质中加入5 种化合物进行添加回收试验。根据国家标准中规定的糙米中农药最大残留限量 (甲维盐0.02 mg/kg，氯虫苯甲酰胺0.5 mg/kg，氟唑菌酰胺1 mg/kg)[8]和仪器灵敏度，甲维盐在3 种基质中的添加水平为0.01、0.02、1 mg/kg；氯虫苯甲酰胺为0.02、0.5、1 mg/kg，氟唑菌酰胺为0.02、1、5 mg/kg；M700F008 及M700F048 在糙米和稻壳中的添加水平为0.02、1、5 mg/kg，在稻秆中的添加水平为0.05、1、5 mg/kg，所有5 mg/kg 的添加样品均采用空白基质液稀释至线性范围后进行检测分析。每个添加水平5 次重复，按照1.3.1 节中的提取与净化方法进行处理，并在1.3.2 节中的条件下测定，计算平均回收率与相对标准偏差 (RSD)。

1.5 基质效应

化合物分析检测时待测成分的离子化效率受共洗脱物质的影响，会引起信号的变化即基质效应，基质效应的存在会影响方法灵敏度，进而影响分析结果的准确性。本研究采用基质标准曲线与溶剂标准曲线斜率的比值 (k) 来判定基质效应，k＞ 1.1 为基质增强效应，0.9≤k ≤1.1 为基质效应不明显，k＜ 0.9 为基质减弱效应[12]。

2 结果与分析

2.1 仪器检测条件确定及优化

为得到5 种化合物的最佳灵敏度和分离效果，采用1 mg/L 混合标准溶液作为工作溶液，在电喷雾离子源 (ESI) 下进行全扫描 (m/z300～900)。结果表明：正离子扫描模式下5 种化合物的母离子峰显著且稳定，随着碰撞电压的增加，母离子峰降低，各子离子峰升高。5 种化合物均具有较好的电离效果，通过调整碰撞电压，获得稳定的特征离子峰[M + H]，对去簇电压 (DP) 及碰撞电压进一步优化，得到最佳质谱条件参数 (表1)。在所设梯度洗脱条件下，对比了水-乙腈、0.2%甲酸水溶液-乙腈和0.2%甲酸水溶液-甲醇作为流动相的分离效果及峰型。结果表明：以0.2% 甲酸水溶液-甲醇为流动相，目标物与杂质有较好的分离效果，且5 种目标化合物均在5 min 内被检出，保留时间分别为2.44、2.42、2.46、2.47 和2.40 min，在目标化合物保留时间内没有干扰。典型谱图见图1。

图1 甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008 和M700F048 的质谱图及其在不同基质中的空白样品添加色谱图Fig.1 Mass spectrogram of emamectin benzoate, chlorantraniliprole, fluxapyroxad, M700F008 and M700F048 and chromatogram of different blank matrix samples spiked with the five compounds

2.2 前处理方法的选择和优化

2.2.1 提取溶剂的选择和优化 乙腈作为QuEChERS方法中常用的提取溶剂，可溶解多种有机物质。随着QuEChERS 方法在实际应用中的改进，研究人员发现在提取时加入一定量的其他试剂，如甲酸、乙酸铵等，可获得满意的回收率[13]。对于偏酸性的物质，酸的加入可抑制其水解，进而提高其回收率。在本研究中，以乙腈作为提取溶剂时，M700F008 的回收率低于70%，在此基础上考察了向乙腈中加入一定量的甲酸(体积分数分别为0.2%、1%及2%)对回收率的影响。结果 (图2)显示：不同甲酸用量下，糙米中5 种化合物的回收率均满足要求，稻壳中甲酸用量为0.2%、1%时的回收率也均在70%～110%之间。但有机酸的大量、连续性使用，容易腐蚀仪器，因此在保证回收率的情况下，从保护仪器的角度选择含体积分数0.2%甲酸的乙腈溶液作为糙米和稻壳基质的提取溶剂。当甲酸用量为0.2%、2%时稻秆中M700F008及M700F048 的回收率低于标准[11]，以1%处理的效果最佳，故选择含体积分数1%甲酸的乙腈溶液作为稻秆的提取溶剂。

图2 甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008 及M700F048 在不同基质和提取溶剂中的平均回收率Fig.2 Average recovery of emamectin benzoate, chlorantraniliprole, fluxapyroxad, M700F008 and M700F048 in different matrices and extraction solvents

2.2.2 净化剂的选择和优化 相对于水果蔬菜等农产品，水稻样品基质种类多，净化难度大。本研究比较了QuEChERS 方法中常用净化剂 (C18、PSA、GCB) 对水稻基质的净化效果。C18可从极性物质中除去非极性物质和中等极性物质[6]，糙米中含有大量淀粉，稻壳中富含纤维素，且粉碎后的稻壳体积较大，因而选用C18作为糙米和稻壳样品的净化剂。比较了C18不同用量 (25、50 和75 mg) 对糙米和稻壳中5 种化合物回收率的影响。结果显示：糙米中以不同用量的C18做净化剂时，5 种化合物的回收率均在81%～106% 内，符合农药残留分析的要求，因而选用最低用量25 mg C18作为糙米基质的净化剂；稻壳中除用75 mg C18作为净化剂时氟唑菌酰胺回收率过高外，其余均在71%～110%之间，从经济成本角度考虑，选用25 mg C18作为稻壳基质的净化剂。稻秆中含有大量色素、有机酸及酚类物质，选用50 mg PSA 和GCB作为稻秆基质的净化剂，并对比了GCB 不同用量 (10、20 和30 mg) 对5 种化合物回收率的影响。结果显示：代谢物M700F048 受GCB 影响较大，其回收率随着GCB 量的增加而降低，可能是由于GCB 主要吸附色素及其他环状化合物，对芳香族的吸附大于对脂肪族化合物的吸附，而氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008及M700F048 具有多环结构，故随着GCB 用量的增加，其回收率呈递减趋势。这与之前的研究报道相符[10,14]，因而选用50 mg PSA 和10 mg GCB作为稻秆基质的净化剂。具体回收率数据见图3。

图3 不同净化剂对糙米、稻壳和稻秆中甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008 及M700F048 回收率的影响Fig.3 Effects of different cleanup sorbents on recoveries of emamectin benzoate, chlorantraniliprole, fluxapyroxad,M700F008 and M700F048 in brown rice, rice husk and rice straw

2.3 方法的线性范围和基质效应

结果 (表2) 表明：甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008 及M700F048 在乙腈、糙米、稻壳和稻秆空白基质溶液中的定量离子对峰面积与相应质量浓度间线性关系良好，R2均大于0.995 5。甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺及M700F048 在糙米中k值为1.12～1.35，说明存在基质增强效应，M700F008 在糙米中k值为0.90，表示基质效应不明显， 5 种化合物在稻壳和稻秆中k为0.11～0.85，说明存在基质减弱效应，且稻壳和稻秆表现出的基质减弱效应大于糙米基质，这主要是由于稻壳和稻秆基质较为复杂，提取液中的干扰物质抑制了目标化合物的离子化效率。因此，为了弥补基质效应对结果定量分析的影响，保证方法的准确性和通用性，采用基质匹配标准曲线对实际样品进行定量分析。

表2 甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008 和M700F048 的线性回归方程、决定系数和基质效应Table 2 Linear equation, determination coefficients, and matrix effects of emamectin benzoate, chlorantraniliprole,fluxapyroxad, M700F008 and M700F048

2.4 方法的正确度、精密度和灵敏度

结果 (表3) 表明：甲维盐和氯虫苯甲酰胺在糙米、稻壳和稻秆中的平均回收率分别在85%～107%和92%～107%之间；氟唑菌酰胺、M700F008和M700F048 在3 种基质中的平均回收率均在71%～119%之间，均符合农药分析方法的要求[11]。以最小添加水平作为方法的定量限 (LOQ)，则糙米和稻壳中除甲维盐LOQ 为0.01 mg/kg，另外4 种化合物的LOQ 均为0.02 mg/kg；稻秆中甲维盐LOQ 为0.01 mg/kg，氯虫苯甲酰胺和氟唑菌酰胺LOQ 为0.02 mg/kg，M700F008 和M700F048的LOQ 为0.05 mg/kg。

表3 甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008 及M700F048 在糙米、稻壳和稻秆中的添加回收率及RSDTable 3 Recovery and RSDs of emamectin benzoate, chlorantraniliprole, fluxapyroxad, M700F008 and M700F048 in three matrices at 3 spiked levels

2.5 实际样品检测

利用建立的方法对采集的稻秆消解动态样品进行了检测。结果发现：仅氯虫苯甲酰胺和氟唑菌酰胺有检出，甲维盐、M700F008 及M700F048均未检出。氯虫苯甲酰胺和氟唑菌酰胺在稻秆中的残留消解动态符合一级反应动力学方程，氯虫苯甲酰胺和氟唑菌酰胺的消解曲线分别为ct=1.32e-0.060t(R2= 0.954)和ct=8.19e-0.055t(R2= 0.854)，其在稻秆样品中的初始沉积量分别为1.31 和9.49 mg/kg，消解半衰期分别为11.6 和12.6 d。同时检测了广西、广东和湖北3 地水稻样品。结果 (表4)显示：3 地最终残留样品中仅检出氟唑菌酰胺和氯虫苯甲酰胺，其中氯虫苯甲酰胺在3 地糙米样品检出量为0.02～0.03 mg/kg，氟唑菌酰胺为0.06～0.08 mg/kg，均低于国家最大残留限量标准1 mg/kg。氯虫苯甲酰胺和氟唑菌酰胺在稻壳中的检出量分别为1.29～3.12 和1.36～4.09 mg/kg，在稻秆中最终残留量分别为0.16～1.15 和0.24～3.64 mg/kg。

表4 甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺、M700F008 及M700F048 在糙米、稻壳和稻秆中的最终残留量(mg/kg)Table 4 The terminal residues of emamectin benzoate, chlorantraniliprole, fluxapyroxad, M700F008 and M700F048 in rice samples (mg/kg)

3 结论

本研究基于UPLC-MS/MS 结合QuChERS 方法，建立了水稻糙米、稻壳及稻秆3 种基质中5 种化合物(甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺及其代谢物M700F008、M700F048)的多残留分析方法。糙米和稻壳样品采用添加了0.2%甲酸水溶液的乙腈作为提取溶剂，以25 mg C18为净化剂；稻秆样品分别以1% 甲酸-乙腈和50 mg PSA +10 mg GCB 作为提取溶剂和净化剂，并检测了广西、广东和湖北3 地的水稻田间试验样品。结果表明，方法的灵敏度、正确度及精密度均满足残留分析的要求，且具有良好的线性关系，操作简便，方法定量限为0.01～0.05 mg/kg，可用于水稻中甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺及其代谢物M700F008、M700F048 残留量的测定。该方法可同时检测5 种化合物，检测效率高，同时本研究结果明确了我国典型产区水稻中甲维盐、氯虫苯甲酰胺、氟唑菌酰胺及其代谢物的残留水平，均符合农产品安全要求。