基于三叉神经节神经元电生理特征的单细胞转录组测序技术方法构建

李腊梅，杨 晶，刘苑莹，史云欣，胡文超，解柔刚，姜 鸣

(1延安大学生命科学学院多肽资源药物研究中心，陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西 延安 716099；空军军医大学基础医学院：2神经生物学教研室，4学员六大队，陕西 西安 710032；3西安国际医学中心心脏病医院，陕西 西安 710109)

三叉神经节(trigeminal ganglion，TRG)位于颅中窝颞骨岩部尖端前侧的三叉神经压迹处，参与口面部区域的各种感觉功能，如非伤害性或伤害性机械、热和化学刺激[1-2]。病理条件下TRG神经元的超兴奋是三叉神经痛的重要原因[3]， TRG神经元中分子的表达变化以及生理特性变化被认为与三叉神经损伤或炎症相关的口面部感觉功能障碍有关[4]。感觉神经节的神经元按照基因表达可进行更为细致的分类[5]。不同形态的细胞类型往往表现出独特的电生理特性。根据TRG小神经元[6]、大鼠三叉神经中脑核神经元[7-8]、大鼠背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)大细胞[9]的兴奋性特征进行分类，其主要类型为3类神经元(激活阈值较高)。然而，不同放电类型的神经元是否具有特殊的基因表达谱仍不清楚。因此，研究感觉神经元的放电模式与其基因表达关系，是研究神经功能的重要环节。

单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)技术是在单个细胞水平上，对转录组进行扩增与测序分析的一项技术，对于检测低丰度转录本和发现新转录本具有其独特的优势[10]。通过定量分析单个细胞和不同细胞类型之间的分子和细胞变化将有助于寻找疼痛疗法的潜在靶点[11]。目前，新出现的一项结合全细胞膜片钳记录和单细胞RNA测序的“Patch-seq”技术[12-13]，具有在单细胞水平上将基因表达与神经功能联系起来的独特优势。本研究通过对小鼠TRG神经元的放电特征记录，并对特定放电模式的神经元细胞进行scRNA-seq，构建了小鼠TRG神经元的Patch-seq技术方法，进一步分析小鼠TRG神经元细胞放电模式及主要离子通道相关基因的表达分布，为进一步研究头面部初级感觉传入的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用4～6周龄健康小鼠，雌雄不限，由空军军医大学实验动物中心提供，动物单笼饲养，昼夜节律为12 h光/12 h暗循环，室温为25 ℃左右，自由摄食饮水。所有操作和动物处理遵循空军军医大学实验动物福利与伦理委员会制定的指导原则(许可证号：20210456)，尽量使动物的痛苦最小化，减少动物使用数量。

1.1.2 试剂 NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、MgCl2、KOH、NaHCO3、葡萄糖、K-Glu、NaH2PO4、NaOH、EGTA、Mg-ATP和HEPES均购自美国Sigma公司。

1.1.3 仪器 Axon Multiclmap 700B膜片钳放大器；AxonTMDigidata® 1550B数模转换器，正置红外微分干涉显微镜(BX51，Olympus，日本)；P-97玻璃微电极拉制仪(Sutter Instrument Company，美国)；万分之一天平(Sartorius，德国)。

1.2 方法

1.2.1 实验溶液及物品准备 麻醉用10 g/L戊巴比妥钠溶液：1 g戊巴比妥钠溶解于100 mL生理盐水中。配置人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)(g/L)：NaCl 7.43，KCl 0.27，NaH2PO40.14，MgSO40.16，CaCl20.27，NaHCO32.18，葡萄糖2.73。用0.04 g/L NaOH或90 mL/L HCl调pH值为7.4(22～24 ℃)。ACSF每次使用前充950 mL/L O2及50 mL/L CO2的混合气饱和0.5～1 h。电极内液(g/L)：KCl 1.34，K-Glu 30.91，CaCl20.15，MgCl20.41，EGTA 0.42，HEPES 2.4，Mg-ATP 2.5，用0.04 g/L NaOH或90 mL/L HCl调pH值为7.4，渗透压调至280～290 Osm/L。实验用手术器械、烧杯、烧瓶、培养皿、玻璃电极管和ACSF等进行高压蒸汽灭菌(120 ℃，15 min)。

1.2.2 TRG标本制备 小鼠(4～6周龄)腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠麻醉后，断头剪开头部毛皮，从颅骨两侧剪开暴露脑子，轻轻将大、小脑剥离，可见颅底一对白色的平行排列的有分叉的组织团即为TRG，在预冷的氧饱和ACSF中剔除神经节周围的血管、脂肪和神经鞘膜等结缔组织后，呈乳白色。将组织块放入2 mL消化酶中(消化酶制备：1 mg蛋白酶和1.6 mg胶原酶用ACSF稀释至2 mL)，于37 ℃恒温水浴中消化30 min。取出组织块，室温下放入氧饱和ACSF中，孵育1～2 h后开始试验。与细胞培养方法相比，对神经元的损伤较小，极大地保存了记录神经元的基本特性。

1.2.3 膜片钳记录神经元兴奋性特征 实验在正置红外微分干涉显微镜下进行，将孵育好的TRG整节移至记录用灌流槽内，用黏有平行细尼龙丝的“U”形铂丝固定神经节。灌流槽置于显微镜载物台上，在5倍物镜下观察TRG神经元细胞的分布，40倍物镜下观察并选择细胞进行可视封接。通过红外微分干涉显微镜观察发现，状态较好的神经元轮廓清晰、表面光滑、看似有弹性，玻璃微电极尖端正压压在表面很容易出现凹陷，并可恢复。而状态较差的神经元则轮廓模糊不清、表面皱缩或者肿胀、对比度透亮并可见到细胞核，电极尖端正压压在表面不易出现凹陷。封接用微电极为薄壁有芯软质玻璃毛坯，经P-97拉制而成，充灌电极内液入水电阻为5～8 MΩ。用微操纵仪控制记录电极尖端接近所选神经元， 在电极接近细胞的过程中，向微电极内施加正压，以防止电极尖端堵塞。在低倍镜下找到电极尖端，并缓慢将电极下降接近TRG组织，转换到高倍物镜下，将电极尖端缓慢调节到所要钳制的细胞上方。缓慢下降微电极，当电极尖端接触细胞表面时，正压会使细胞表面出现一个小凹，同时从Seal Test上显示封接电阻增加0.1～0.2 MΩ。此时撤去正压，并给予一定的负压，缓慢将钳制电压逐渐调至-60 mV，使其形成巨阻封接。以上步骤成功后采用脉冲短促负压吸引进行破膜，形成全细胞模式。在电流钳状态下记录神经元兴奋性特征，选择静息电位<-50 mV、动作电位超射>20 mV的神经元进行下一步的实验。

1.2.4 单细胞样本获取 不同于传统脑片“Patch-seq”技术，TRG神经元直径较大，用记录电极直接拉取细胞失败率较高，需要更换口径较粗的电极，电极入水电阻为2～4 MΩ，进行二次钳制以拉取细胞，可增加成功率。以同样的方法用微操纵仪控制电极尖端接近1.2.3中记录完神经元放电特征的神经元，此时只需用较大的负压将细胞牢牢吸引住，然后用微操纵仪缓慢移动电极，将电极吸引的细胞从神经节上拉下来，期间可再次给负压以吸引住细胞，防止电极移动过程中细胞掉落。用微操纵仪控制电极出灌流槽子液面时速度需非常缓慢，防止出液面时细胞掉落。之后，迅速取下电极，将玻璃微电极尖端轻轻折断进入装有裂解液的低吸附管中，做好标记，-80 ℃冰箱冻存，供下一步进行scRNA-seq实验。实验过程中要求实验人员应戴口罩、手套，实验器械、器皿和玻璃电极应提前灭菌消毒，实验操作过程中避免说话，细胞取出过程应迅速，细胞脱离组织后应立即放入裂解液，防止RNA降解。

1.2.5 样本文库构建与质检 将1.2.4中获取的单细胞样本，经SMART-Seq®HT Kit放大后得到cDNA，对cDNA进行片段化、末端修复、3′末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建。经Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, 美国)质检合格后备用。

1.2.6 测序实验 使用Illumina NovaSeq 6000测序仪，选用PE150模式进行测序。测序质控标准为每向碱基质量大于20(Q20)的比例≥85%。

1.2.7 测序数据分析 对测序结果进行GO分析。首先，对生物过程、细胞成分、分子功能三个层次上对应的样本表达基因数目进行统计，将统计结果用柱状图展示。将所挑选的基因向GO数据库的各个条目映射，计算每个条目的基因数目，然后应用超几何检验，与整个基因组背景相比，筛选所表达基因中显著富集的GO条目，以散点图的方式展示富集程度排名前30的GO条目。对各个通路上的表达基因数目进行KEGG统计，将统计结果用柱状图展示。与GO富集相同进行KEGG富集分析，以散点图的方式展示富集程度排名前30的KEGG通路。

2 结果

2.1 小鼠TRG的取材和TRG神经元细胞的分布

小鼠经腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠麻醉，断头后剪开头部毛皮，暴露并剥离脑后，可见颅底一对白色平行排列的有分叉的组织团即为TRG(图1A)。在预冷的氧饱和ACSF中剔除TRG周围的血管、脂肪、神经鞘膜等结缔组织后，可成功分离出乳白色的TRG，其神经元细胞分布位置如图1B。在正置红外微分干涉显微镜物镜下可观察到透明串状分布的TRG神经元细胞(图1C)。

A：小鼠TRG图；B：小鼠TRG神经元细胞分布位置；C：显微镜下小鼠TRG神经元细胞图(×5)。红色虚线标记为TRG神经元细胞。TRG：三叉神经节。图1 小鼠TRG神经元分布

2.2 膜片钳记录TRG神经元的兴奋性

对TRG神经元进行全细胞膜片钳记录(图2A)，进行电流钳记录时，选择静息膜电位<-50 mV、动作电位超射>20 mV的神经元进行记录。主要记录TRG中大型细胞，其放电特征为：给予方波刺激时只产生单个动作电位，诱发动作电位的基强度较高[(800.00±129.10) pA)](图2B)，图2C显示了神经元放电个数与注入电流强度之间的关系。当给予斜波刺激时，神经元在注入很大电流(1 500 pA)的情况下，也不能产生动作电位(图2D)。以往对DRG大神经元兴奋性分型研究中，对注入去极化方波刺激只能产生单个动作电位，且斜波刺激不能诱发出动作电位的神经元称为3类神经元[9]。本研究在TRG上记录到的该种放电模式的神经元即为3类神经元，其所占比例为73%(35/48)。该类兴奋性神经元的膜特性及动作电位特征为静息膜电位为(-61.09±2.10)mV，膜电容为(63.07±10.99)pF，膜电阻为(48.20±20.10)MΩ，动作电位幅值为(94.43±15.30)mV，动作电位阈电位为(-32.06±2.94)mV，动作电位半宽为(2.05±0.80)ms，基强度为(800.00±129.10)pA。

A：显微镜下TRG神经元(×40)；B：去极化方波刺激只产生一个动作电位；C：刺激电流强度与放电个数的关系；D：斜波刺激不能诱发出动作电位。TRG：三叉神经节。图2 TRG中大型3类神经元放电特征

2.3 神经元兴奋性记录完成后神经元细胞的获取和收集

兴奋性记录完成后神经元细胞的获取过程如图3所示，用口径较粗(入水电阻：2～4 MΩ)的玻璃电极，进行二次钳制，此时需用较大的负压将细胞吸引住(图3A)，缓慢移动电极，将细胞从TRG上拉下来(图3B～D)。之后，迅速取下电极，将玻璃微电极尖端轻轻折断进入装有裂解液的低吸附管中(吸附管需置于冰块中)，供下一步进行scRNA-seq实验。

A：玻璃微电极吸引细胞；B～D：缓慢移动玻璃微电极将细胞拉取出来。图3 Patch-seq技术获取神经元的过程

2.4 SMART-Seq构建文库和测序质检

将2.3中收集的单细胞样本经SMART-Seq®HT Kit放大后得到cDNA，对cDNA进行片段化、末端修复、3′ 末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建。采用Agilent Bioanalyzer 2100 检测文库大小，主峰在300 bp左右(图4)，说明mRNA的完整性好。测序数据质控结果Q20为96.57%，满足测序质控要求(>85%)。所构建文库可以进行上机测序，说明通过膜片钳玻璃微电极获取单个细胞的技术方法是成功的，可以获得高质量的细胞进行scRNA-seq。

图4 Agilent Bioanalyzer 2100检测文库大小结果

2.5 测序序列质量评估

质检合格的样本进行上机测序，样本采用双端测序，双端测序质量评估结果均合格。测序序列质量评估Q值盒图中90%的质量值为高质量数值(图5A)，且GC和AT碱基对均衡分布(图5B)，每条序列的测序质量主要集中在30～40中(图5C)，说明样本测序质量较好，测序序列长度为151 bp，且151 bp是主要的(图5D)，说明测序结果优良。

A：Q值盒图统计，上下的黑线代表占90%和10%对应的碱基质量值，蓝线表示质量数值的平均值、绿色背景部分代表高质量数值部分、橘色背景部分代表合理质量数值部分、红色背景部分代表低质量数值部分；B：碱基分布图；C：序列质量评分分布图；D：序列长度分布图。图5 测序序列质量评估方法

2.6 测序基因表达分析

测序分析共检测了34 746种基因，在上述放电模式的TRG神经元细胞检测到17 057种基因。根据该类TRG神经元细胞中表达的基因数目进行GO分析，图6A展示了样本表达基因数的富集情况，主要富集在细胞过程、细胞组分和分子结合等通路。图6B为最显著的30条GO富集通路，其主要与tRNA加工、剪接前体和非甲基化CpG结合等功能有关。另外，进行KEGG分析，其主要富集在全局和总览图、内分泌系统、癌症概述、信号转导以及运输和分解代谢等通路(图6C)。图6D为最显著的30条KEGG富集通路，主要与泛素介导的蛋白水解、剪接体、内质网蛋白加工等功能相关。进一步分析该放电类型的TRG神经元中的Na+通道和K+通道相关基因(SCN和KCN)，发现二者比例无显著差异(图6E)。然而，在该放电类型神经元中，Na+通道的亚型分布比例有其显著的特征，其中编码Na+通道β1亚型(NaVβ1)的基因SCN1B占主导，比例为53.6%。而与疼痛相关的Na+通道α亚型中编码NaX通道的SCN7A基因占比最高，为12.3%，NaV1.7、NaV1.8和NaV1.9通道对应的编码基因SCN9A、SCN10A和SCN11A则分别占比为2.3%、8.4%和4.4%(图6F)。在K+通道的亚型分布中，与抑制疼痛相关的基因KCNIP3占主导，比例为25.4%，另外与调节神经元兴奋性相关的KV1.2、KVβ2、KV3.4和KV7.4通道对应的编码基因KCNA2、KCNAB2、KCNC4和KCNQ4分别占比为2.7%、5.6%、3.3%、5.4%(图6G)。

A：GO富集分析柱状图，横坐标表示表达基因数目，纵坐标表示不同的GO术语；B：GO富集分析散点图，纵坐标表示不同的GO术语，横坐标表示注释到某条GO术语的富集程度；C：KEGG富集分析柱状图，横坐标表示表达基因数目，纵坐标表示不同的KEGG通路；D：KEGG富集分析散点图，纵坐标表示不同的KEGG通路，横坐标表示注释到某条KEGG通路的富集程度；E：Na+和K+通道基因表达分布；F：Na+通道SCN基因表达分布；G：K+通道KCN基因表达分布。图6 基因表达分布

3 讨论

TRG是头面部感觉传入的中转站。在正常生理条件下，TRG神经元仅仅对外周信息进行忠实传导，不产生或只产生极少的自发放电。而在许多神经病理痛模型中，初级感觉神经元往往会产生异位自发放电，这些自发放电成为动物自发痛、触诱发痛及痛觉过敏等异常痛行为的起源[14]。

感觉神经元与兴奋性关系最为密切的通道是Na+通道。电压门控型Na+通道是一个庞大的家族，按照其α亚基的不同可分为不同亚型，主要为NaV1.1～NaV1.9以及NaX，别名分别为Rat I/HBSCI、Rat II/HBSCII、Rat III、SkM1/μ1、SkM2/H1、NaCh6/PN4、PN1/NaS/hNE、SNS/PN3、NaN/SNS2/PN5和NaG。其中有四种Na+通道为DRG或TRG神经元所特有，分别是NaV1.7、NaV1.8、NaV1.9和NaX。NaV1.7是一种在外周神经系统高表达的Na+通道，同时表达于所有的背根节神经元，它编码一种具有较低的激活阈值和较快的通道活性特性的、TTX敏感的Na+通道，可能参与神经元动作电位的形成[15]；NaV1.8主要在背根节小细胞及TRG神经元中表达,其是一种去极化激活的电压敏感Na+通道，有较高的激活阈值及快速激活、缓慢失活的动力学特性，对高浓度TTX不敏感[16]；NaV1.9主要在DRG小细胞和TRG神经元中表达，具有较低的激活阈值和相对较快的失活速度[17]。对初级感觉神经元兴奋性的研究有助于我们了解神经元对外界感受刺激的响应模式，进而阐明在生理和病理条件下的神经功能变化。因此，结合细胞基因表达谱以及神经元功能的方法将深入扩展以上的研究。

在本研究中，我们通过全细胞膜片记录到73%(35/48)的TRG兴奋性神经元的放电模式为“忠实传导”式神经元，在方波刺激条件下只产生单个动作电位，并且基强度较高[(800.00±129.10)pA]，而给予斜波刺激时，神经元在注入很大电流的情况下(>1500 pA)，也不能产生动作电位。针对该种放电特征的TRG神经元，用膜片钳记录的玻璃微电极吸取并收集进行scRNA-seq。采用SMART-Seq®HT Kit放大后得到的cDNA，经Agilent Bioanalyzer 2100质检验证所获得的细胞样本合格，可满足测序样本量的要求。进一步的测序质量评估显示测序结果优良。以上结果提示对小鼠TRG神经元的Patch-seq技术方法的成功建立。

进一步测序分析，对上述放电模式的TRG神经元细胞中表达的基因进行了GO功能分析和KEGG通路分析。另外，对该放电类型的TRG神经元中与Na+通道和K+通道相关的基因的亚型分析显示，编码Na+通道β1亚型(NaVβ1)的基因SCN1B占比最高，为53.6%，该基因缺失，神经元存在持续性内向钠电流，兴奋性会增加。在Na+通道α亚型中NaX作为一种Na+浓度感受器，其编码基因SCN7A占比最高为12.3%，而NaV1.7的编码基因SCN9A占比为2.3%，NaV1.8的编码基因SCN10A占比为8.4%，NaV1.9的编码基因SCN11A占比为4.4%。表明在该类型细胞中NaV1.7通道占比较低，NaV1.7作为一种神经元放电的起搏点，会使神经元产生串放电[18]。在K+通道中，KCNIP3基因占比最高为25.4%，该基因被认为是疼痛产生过程中的一种关键转录抑制子[19]。然而，需要对病理状态下的神经元进行Patch-seq分析比较，才能够进一步分析在病理状态下神经元兴奋性改变与基因图谱变化之间的关系，为进一步理解疾病状态，寻找疾病治疗的靶点提供依据。