三种组织透明化方法在神经科学应用中的比较

黄义源，杨 亮，袁 洁，智 娜，刘育明，张 明，赵湘辉

(1延安大学生命科学学院多肽资源药物研究中心，陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西 延安 716099； 2西北大学生命科学学院，陕西 西安 710127； 3空军军医大学基础医学院神经生物学教研室，陕西 西安 710032)

近年来，各种神经连接介观图谱成像技术不断发展成熟，不但为探索神经和精神疾病的发生机制提供了重要的理论和方法，更成为脑功能成像大数据共享和开放式脑科学研究的热点[1]。其中，基于组织透明化的高分辨显微成像技术在探索神经连接介观图谱特征与神经系统功能异常的关系中发挥重要作用[2-3]。组织透明化的方法不但可以在不破坏神经纤维间联系的基础上实现对一定厚度，甚至全脑的单细胞分辨率介观尺度成像，还可以与包括免疫荧光化学在内的多种细胞标记方法相匹配，从三维立体的空间层面实现对脑区间神经联接的长程投射和局部微环路解析[4-5]。现阶段透明化的方法大致可分为三类：溶剂透明技术、水性超水合技术和水凝胶包埋技术[6-7]。不同的方法原理不同，在透明清除时间、荧光保存效果、组织是否形变、是否和免疫荧光技术兼容、适用组织厚度等方面侧重不同[8-10]。本研究以小鼠厚脑片(150 μm)为研究对象，通过对上述要素的比较，探讨了基于水凝胶包埋的PACT(passive CLARITY technique)[11-12]、基于尿素透明化技术改进的MACS(MXDA-based Aqueous Clearing System)[13]和基于溶剂透明技术的Visikol HISTO[14]试剂盒三种方法的优势与缺点，将为相关领域研究人员选择操作简便、兼顾免疫荧光标记方法、能处理一定厚度的组织且基本不发生形变、处理时程较短，而且重复性好的方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：本研究中所使用的动物在空军军医大学实验动物中心SPF级动物房饲养，保持室内温度24 ℃左右，相对湿度维持在50%左右，照明为12 h光/12 h暗循环。转基因小鼠品系为CNP-mEGFP[15]，GAD67-GFP[16](RRID:IMSR_JAX:007677),Tir2CreER[17](RRID:IMSR_JAX:030597)和TdTomato[18](RRID:IMSR_JAX:007905)。将Tir2CreER小鼠与TdTomato小鼠交配获得Tir2CreER-TdTomato转基因鼠，诱导该小鼠表达Tir2Cre时，按照100 μg/g体质量进行小鼠腹腔注射Tamaxion(Sigma，#WXBD2299V)，动物灌注取材年龄为出生后第42日(P42)，P37～P39连续3 d注射Tamaxion。本研究用到的动物年龄在相应结果部分分别介绍，每种实验用到动物数量为3只，雌雄不限。所有动物实验均经过空军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准执行(许可证号：20211020)。

主要试剂及仪器：光引发剂VA-044(WAKO，#V10588)，DABCO(Merck，#8.03456.0100)，Nycodenz(Alere Technologis AS，#10187824)，间苯二甲胺(m-xylylenediamine，MXDA，Tokyo chemical industry，#D0127)，山梨醇(Sigma，#85529)，Visikol HISTO(Abcam，#ab243298)，十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS，MP，#MR29129)，PBS(Solarbio，#P1010)，翘板摇床(DlAB，#SK-R330-Pro)，水浴锅(JULABA，#SW22)。FV3000激光共聚焦显微镜(奥林巴斯)。

免疫荧光染色使用的抗体见表1。

1.2 方法

1.2.1 灌注固定及组织样品准备 将所有实验小鼠用10 g/L戊巴比妥钠(0.008 mg/kg)深度麻醉，先后经冰冷的1×PBS(配方见1.2.2)和冰冷的40 g/L多聚甲醛(KH2PO415.6 g/L，NaOH 4 g/L配置)固定液心脏灌注，断头后去除头部皮肤与颅骨，小心取出鼠脑，并置于4 ℃冰箱固定过夜。次日将样品放置在含0.001 g/L叠氮钠的PBS中备用。将固定好的样品进行适当修整，用502胶水固定在震动切片机上，进行冠状面脑片的制备。切片时刀片速度和振幅根据脑组织的固定程度进行调整，保证脑片可以完整而顺利地切下。

1.2.2 组织透明试剂的配制 PACT透明化方案参考文献[11-12]配置相关试剂：A4PO水凝胶单体溶液[20 mL丙烯酰胺溶液(400 g/L)，10 mL 20×PBS母液(Na2HPO4529.2 g/L，NaH2PO42.66 g/L，NaCl 40 g/L，KCl 1.8 g/L)，170 mL dH2O定容至200 mL，pH 7.5，在使用前先加入终浓度0.025 g/L的光引发剂]；80 g/L SDS溶液(SDS粉末8 g溶于100 mL 1×PBS，pH 7.5)；折射率匹配溶液(refractive index matching solution，RIMS)[40 g Nycodenz，30 mL PB (KH2PO42.72 g/L，0.64 g/L)，5 mg叠氮钠，50 μL Tween 20，1 g DABCO，溶解后即为50 mL溶液]。

MACS透明化方案参考文献[13]配置相关试剂：MACS-R0(200 mL/L MXDA，150 g/L山梨醇，去离子水溶解)；MACS-R1(400 mL/L MXDA，300 g/L山梨醇，1×PBS溶解)；MACS-R2(400 mL/L MXDA，500 g/L山梨醇，去离子水溶解)。

Visikol HISTO透明化方案所需配制的试剂根据制造商提供的说明书进行操作。Visikol HISTO提供的洗涤缓冲液为10倍浓度，使用前将其用去离子水稀释至1倍，调至pH 7.4。对于含有内源荧光蛋白的样品，利用1×PBS(pH 7.4)制备300、500 mL/L的乙醇溶液，利用去离子水制备700、900 mL/L的乙醇溶液；对于不含内源荧光蛋白的样品，在1×PBS中稀释制备500 mL/L甲醇溶液，利用去离子水制备700、900 mL/L甲醇溶液。

1.2.3 组织透明化步骤 在利用PACT方法处理厚脑片时，先将固定清洗好的样本转移至含有A4PO溶液的5 mL离心管中，液体量为组织体积的两倍并保证没过样品，4 ℃静置过夜。第2日，将离心管取出并在37 ℃水浴中孵育4～5 h，聚合组织-水凝胶基质。以PBS多次充分清洗组织，完全除去多余的水凝胶单体。将清洗好的样品放入SDS中(根据样品厚度和大小，在20～80 g/L范围内选择适应浓度的SDS)，37 ℃轻微摇晃，直到组织肉眼可见透明时弃去SDS溶液，用1×PBS充分清洗样品，完全除去多余的SDS。通常厚度为200 μm的脑片需要2～4 h达到完全透明。将组织保存在含0.001 g/L叠氮钠的1×PBS中，以待进行后续染色或成像。

MACS组织透明化方案的步骤如下：将固定清洗好的样品依次在MACS-R0、MACS-R1、MACS-R2溶液于室温中轻微摇晃孵育，达到完全透明的处理时间根据组织的厚度确定。通常厚度为200 μm的脑片需要0.5～1 h达到完全透明。值得注意的是，为了更好地保存内源荧光信号，透明化处理期间的温度应保持在30 ℃以下。

Visikol组织透明化方案的步骤参照说明书进行：对于含有内源性荧光的样本，将固定清洗好的脑片，依次在300 mL/L乙醇/PBS、500 mL/L乙醇/PBS、700 mL/L乙醇/去离子水、900 mL/L乙醇/去离子水、无水乙醇中室温轻晃孵育15 min，脱水之后可进行成像前准备。对于需要进行免疫组化标记的样本，先将样品在Visikol HISTO通透缓冲液中过夜室温孵育，以增强组织透过性，之后将样本依次在1×PBS、500 mL/L甲醇/PBS、800 mL/L甲醇/去离子水，以及无水甲醇中室温轻晃孵育15 min。脱水处理后再依次经过200 mL/L DMSO/甲醇、800 mL/L甲醇/去离子水、500 mL/L甲醇/PBS、PBS，以及PBST(含有2 mL/L Triton X-100的1×PBS)中孵育，以便进行后续染色。

1.2.4 透明化样本的免疫荧光染色标记和小分子荧光标签标记 PACT透明化方案处理过的组织，先用封闭液(50 mL/L驴血清，5 mL/L Triton X-100，0.001 g/L叠氮钠，1×PBS配置)室温轻摇孵育2 h；再以一抗(封闭液配置)室温轻摇孵育24～48 h(时间根据样品的动物年龄和染色效果调整)；用1×PBS多次充分清洗组织，再以二抗(1×PBS配置)室温轻摇孵育24～48 h；以1×PBS多次充分清洗，最后以核染料DAPI(1∶1 000)室温轻摇孵育2 h；最后用PBS充分清洗并保存于4 ℃，等待进行成像前的准备。

上述MACS透明化方案处理后的脑片样品，先用500 mL/L MXDA/PBS溶液室温孵育10～15 min，并以1×PBS多次充分清洗。再用上述封闭液在37 ℃孵育2 h，然后以一抗(封闭液配置)室温孵育48 h；用PBST多次充分清洗；再以二抗(封闭液配置)室温孵育24 h。最后用PBST多次充分清洗保存于4 ℃的PBS中，等待进行成像前的准备。

将上述Visikol透明化方案处理后的样品，按照说明书步骤置入Visikol HISTO渗透缓冲液室温轻晃孵育30 min，然后置入Visikol HISTO封闭液于37 ℃封闭2 h，随后一抗(Visikol HISTO抗体稀释液稀释)37 ℃孵育48 h；用Visikol HISTO洗涤缓冲液清洗5次，并以二抗(Visikol HISTO抗体稀释液稀释)37 ℃孵育24 h。再次充分清洗后，以DAPI室温孵育30 min衬染核，并最后清洗样品10次。在染色完成后将样品依次置入500 mL/L的甲醇/PBS，800 mL/L的甲醇/去离子水，以及无水甲醇中处理10～15 min使样品脱水，之后进行成像前的准备。

标记血管时，用PBS稀释的Isolectin B4染料，直接代替上述染色步骤的抗体孵育过程即可，室温处理24 h。

1.2.5 成像前折射率(refractive index，RI)匹配与显微成像 将上述PACT透明化方案处理并做了荧光标记的组织，浸入RIMS溶液(RI=1.44～1.46)中，直到组织重新透明并达到RI匹配即可成像观察(200 μm脑片，通常0.5 h即可透明)；将上述MACS方案处理并做了荧光标记的组织，浸入MACS-R2溶液中(RI=1.52)以达到RI匹配。将上述进行Visikol透明化方案处理并做了荧光标记的组织，浸入Visikol HISTO-1(RI=1.5)或Visikol HISTO-2溶液(RI=1.53，用于厚度>200 μm的样品，如全脑、胚胎、厚脑片等，可强化透明效果)进行成像。

本研究中成像系统使用的是配备了30倍硅油物镜(UPLSA030XS，NA 1.05，WD 0.8 mm)的奥林巴斯FV3000激光扫描共聚焦显微镜，硅油介质的RI接近透明化组织(RI=1.406)，从而实现大体积的生物体高分辨率三维成像。成像时选用1 024×1 024分辨率，扫描速度为2～4 μs/pixel，Z轴扫描步进根据成像信号选取系统的最佳值。成像时，汞灯强度可适当下调至50%，激光功率应不超过4%以减少光毒性，防止荧光淬灭。

2 结果

2.1 透明化处理时间及效果比较

根据我们的实验比较，利用厚脑片(150 μm)进行三种方案透明化处理过程中，PACT方法所需时间最长，2 d左右，Visikol次之，需约2 h，MACS所需时间最短，需约1 h(图1A)；但三种方法透明化效果基本一致(图1B)。在组织形变方面， Visikol处理后的组织由于完全脱水，在完成透明化后相较于原组织会产生一定的收缩；MACS方法在透明化过程中会使得组织膨胀，并且不会在RI匹配后恢复；PACT在组织处理过程中，即SDS洗脱组织内的脂质时，也会引起组织膨胀，但在浸入RIMS后，组织会再次收缩，大小可恢复到透明前的形态(图1B)。在处理后组织的完整性方面，PACT透明化后的厚脑片会变得柔软易碎；而MACS处理后的组织虽然柔软但具有韧性，且有一定的抗拉扯性；Visikol处理过的厚鼠脑切片变得坚硬，且不易破损。

A：三种不同透明化方法流程简图；B：三种不同透明化方法对150 μm厚脑片的透明化效果图。标尺为5 mm。图1 三种不同透明化方法流程简图和透明化效果图

2.2 组织内源性荧光样本的透明化成像结果

在对动物年龄为P42的三种带有内源性荧光的转基因小鼠脑片样品的透明化处理中，发现CNP-mEGFP标记的髓鞘结构、GAD67-GFP标记的中间神经元、Tir2CreER-TdTomato标记的血管结构，在经PACT和MACS的方法处理后均保存较好，并未引起明显的荧光淬灭(图2)。对于GAD67-GFP样品，PACT方法的荧光信号清晰，且背景干净。相反的，尽管说明书提到Visikol试剂可以用于内源性荧光样本的处理，但我们在三种内源性荧光样本中均未看到较好的形态结构，透明化后均失去原荧光信号的形态，甚至出现类似血管样的非特异荧光着色。根据说明书提示，我们缩短了脱水过程的时间，并且在4 ℃低温条件下孵育Visikol HISTO-1溶液进行RI匹配，但仍然没有改变荧光信号消失淬灭的情况(结果未显示)。

2.3 免疫荧光染色样本的透明化成像结果

2.3.1 核型抗原的免疫荧光染色 选用了少突胶质细胞谱系标记物Olig2作为核型抗原的代表，在对P35的小鼠厚脑片进行三种透明化处理方法结合免疫荧光染色后，均较好地完成抗原的标记(图3)；而Visikol方法的信噪比更高。同时，与其他两种透明化方法相比，Visikol方法染色中虽然抗体能够较好地穿透整个组织，但会出现着色不均匀的情况：一侧的荧光信号和背景略高于另一侧。

MACS、PACT、Visikol三种方法下Olig2免疫荧光染色XY平面(左)及Z轴(右)成像结果。标尺为150 μm。图3 核型抗原Olig2的免疫荧光染色结果

2.3.2 胞质抗原的免疫荧光染色 对于以成熟少突胶质细胞标记物CC1为例的胞质抗原的免疫荧光染色，在对P35的小鼠厚脑片进行三种透明化处理方法结合免疫荧光染色后，三种透明化方法均可在一定厚度下较好地实现抗原标记(图4)，但MACS方法标记的细胞染色信号更加均匀。虽然Visikol方法处理后的免疫荧光染色信噪比较好，但仍会出现上述着色不均匀的情况。

MACS、PACT、Visikol三种方法下CC1的染色XY平面(左)及Z轴(右)成像结果。标尺为150 μm。图4 胞质抗原CC1的免疫荧光染色结果

2.3.3 胞膜抗原的免疫荧光染色 以高表达于少突胶质前体细胞膜的受体分子PDGFRα为例，在对P7的小鼠厚脑片进行三种透明化处理方法结合免疫荧光染色，PACT和MACS方法均可标记抗原分子，但是信号主要以胞体为主，细胞突起的精细结构并不能很好地被标记上(图5)；PACT方法标记的PDGFRα信号明显弱于MACS方法，但两种方法处理后抗体穿透效果较好。经Visikol方法处理后，可以看到较完整的包括突起分支的PDGFRα阳性细胞形态，但抗体穿透效果并不理想：150 μm的小鼠脑切片，只有50 μm左右的厚度可以进行免疫荧光标记。

MACS、PACT、Visikol三种方法下PDGFRα的染色XY平面(左)及Z轴(右)成像结果。标尺为150 μm。图5 胞膜抗原PDGFRα的免疫荧光染色结果

2.3.4 MACS方法对免疫荧光染色中不同荧光素的选择性 在MACS透明化方法结合免疫荧光染色的结果中发现，在以Olig2、CC1为抗原，对P35的小鼠厚脑片进行染色，以及在以Iba1为抗原，对P7的小鼠厚脑片染色，若使用Alexa FluorTM488标记的二抗处理后，经激光器激发将导致荧光信号显著淬灭，无法对其进行成像(图6)。而相同抗原经Alexa FluorTM594标记的二抗处理后，经594 nm激发波长可以较好地保持荧光信号，并未出现淬灭现象。这种对免疫荧光染色二抗的荧光素选择性的现象在另外两种透明化方法中并未见到(结果未显示)。

A：以Alexa FluorTM 488二抗标记Olig2(绿色)，以Alexa FluorTM 594二抗标记CC1(红色)的成像结果；B：以Alexa FluorTM 488二抗标记CC1(绿色)，以Alexa FluorTM 594二抗标记Olig2(红色)的成像结果；C：以Alexa FluorTM 488二抗标记Iba-1的成像结果；D：以Alexa FluorTM 594二抗标记Iba-1的成像结果。标尺为80 μm。图6 MACS方法处理后免疫荧光染色中不同荧光素的染色结果

2.4 荧光小分子化合物标记的透明化成像

在以凝集素Lectin对血管标记的小分子探针染色中，虽然三种透明化方法处理后均可实现对血管的标记(图7)，但是可以看出MACS处理后，标记血管的形态不能完整地展示，出现许多断裂的信号。而PACT方法处理后标记的血管不完全，且标记亮度不均一。Visikol方法对Lectin的染色标记效果最好，血管形态完整，未发生明显形变，且信噪比较高。

MACS、PACT、Visikol三种方法下Lectin的染色XY平面(左)及Z轴(右)成像结果。标尺为150 μm。图7 荧光小分子化合物标记的透明化成像结果

3 讨论

近年来组织透明化方法介导的三维立体成像技术已经在神经科学研究中受到更多的关注，特别是针对全脑和小鼠胚胎等较大体积的组织块，组织透明方法为获取其中特定细胞类型和靶蛋白的空间定位信息提供了重要的手段[19-20]。相较于连续切片后重新整合构建的三维成像技术而言，透明化方法无需特殊设备，即可简便开展。此外，除了在较大空间尺度上探讨细胞和靶蛋白的位置信息，比如开展神经环路研究以外，对一定厚度的脑切片进行透明化处理并获得特定空间范围内的细胞数量、细胞间相互作用、特定靶蛋白分布等信息，也是透明化技术的重要应用方向[20-21]。而面对不同荧光标记方法如何选择最适透明化方案，是大多数实验室开展相关应用研究面临的首要问题[22]。

随着各种组织透明化技术的发展，对较厚的组织，甚至全脑进行透明化的效果已经得到完善，多种方法可以在短时间内使组织达到透明效果，并与内源性荧光标记方法相适配[23-25]。比如，带有荧光报告基因的转基因动物，或者脑区定点注射编码荧光蛋白的嗜神经病毒。这两种方法在荧光亮度和均一性方面特别适合厚组织或者全脑成像，但在标记细胞类型的广泛性方面受到一定限制。采用免疫荧光技术对特定神经细胞标志物染色的方法基本不受现有荧光转基因动物和荧光病毒的限制，在一定厚度的组织中可以对特定细胞类型和结构实现较好的标记。但是由于抗体穿透范围的影响，对更厚或者全脑透明化组织实现标记仍具有一定的技术困难。因此在观察神经系统脑区间投射联系和解析局部神经结构的细微差别研究中可以联合应用上述三种细胞标记策略，实现对特定靶标的三维成像。

透明化技术的关键是使光透过一定厚度组织样品时与介质的RI相匹配，从而减少光在组织中各个方向的非均匀散射，且通过去除组织中有色物质，达到组织透明的效果。本实验选用了三种常用的透明化方法，其中PACT透明化技术是一种水凝胶组织透明化方法，借助丙烯酰胺与组织相互耦联形成水凝胶聚合物，之后用SDS对组织进行脱脂，使组织达到初步透明，最后将组织浸入RIMS中达到RI匹配利于成像[11-12]；MACS组织透明化技术是在以尿素为基础的透明化方案基础上，用MXDA改进的一种快速水处理方法，实现短时间内完整组织器官的高度透明化，并表现出对荧光染色的高度相容性[13]。Visikol透明化技术是VILLANI等[14]在水合氯醛溶液的基础上，基于一种独特的多氯代醇混合物，经过光学和超分子特性的优化，使溶液可以渗透进组织深处，达到透明化效果。Visikol溶液中含有甘油，可增加溶液的黏度和溶解度，使其适配于更多的组织样品。

我们选用了150 μm的厚脑片作为研究对象，这相比普通免疫荧光的常规厚度(冰冻切片通常12～14 μm，漂片通常30 μm)扩大了5～10倍的空间范围，不但可以观察到完整的细胞形态，还可以更准确地反映细胞数量等统计相关信息。从透明化效果来看，上述三种方法没有明显差别，但是PACT透明化方法所需时间最长，而MACS方法对样本完整性的保存更好。在内源性荧光样本的处理方面，PACT和MACS方法对荧光的保存明显优于Visikol方法，这可能与Visikol方法预处理时，需在不同梯度的甲醇/乙醇中处理样本，导致其内源荧光发生淬灭有关。但是在利用抗体或者小分子化合物标记特定靶蛋白的荧光标记过程中，我们观察到PACT方法与胞核和胞质抗原标记均能较好兼容，而胞膜抗原信号较弱，这可能与透明处理中使用到SDS对脂膜上的抗原造成一定程度的损害有关。MACS方法对于三种类型的抗原均能均匀着色且能很好地展示；但值得注意的一点是，该方法与免疫荧光染色中488 nm激发波长的荧光二抗不能兼容，绿色荧光不易保持，极易淬灭,而内源性488 nm激发波长的荧光并不受到影响。尽管目前我们对导致这一现象的原因还不清楚，但在今后的应用中需要特别注意避免。与上述两种方法相比，Visikol方法在染色均匀性方面存在明显不足，特别是在胞质和胞膜抗原着色方面。这可能与组织处理后影响抗体穿透力有关，也可能与增大了组织黏度，不利于抗体分子扩散有关。针对这种情况，在今后的实验中我们考虑延长抗体孵育时间，增加抗体孵育时的浓度，以期改善染色效果。

在利用偶联有荧光素的凝集素Lectin标记血管这类连续结构时，Visikol方法表现最好，无论血管的连续性，还是标记信号的均匀程度均优于其他两种方法，可见该方法对小分子化合物的标记效果好于抗体等大分子的标记。PACT方法处理后，部分血管标记不充分；而MACS方法出现标记的血管有断裂的情况。这可能与MACS方法在透明化处理过程中组织发生膨胀，导致微观形态被破环有关。

总之，通过本研究我们针对厚脑片的相关三维成像研究提出了不同荧光来源最适合的透明化方案及注意事项。这些经验可以指导神经发育、神经损伤修复、神经退行性疾病等神经科学多方面的应用与研究，为相关领域技术人员提供实用性帮助。在今后更多类型的抗原标记和样本处理过程中，我们将探讨新的透明化方法以改进目前存在缺陷的部分染色标记结果，并优化已有透明化方法的应用方案。