幼年特发性关节炎相关性葡萄膜炎患儿外周血CDld(hi)CD5+CD19+调节性B细胞的变化及意义

赵文燕，佘 磊

0引言

幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是儿童时期常见的慢性风湿性疾病，外周关节炎为其主要表现，目前有学者认为其发病是由遗传和环境因素引起的[1]。JIA常伴有淋巴结、皮肤、肝脏等全身多系统受累，而JIA相关性葡萄膜炎(juvenile idiopathic arthritis-associated uveitis，JIA-U)是JIA最严重的关节外表现，其在JIA患儿中具有极高的发病风险，通常主要表现为慢性前葡萄膜炎，并且早期无任何眼部不适症状，当出现虹膜黏连等症状时已严重威胁到患儿的视力，所以早期检测和治疗极为必要[2-3]。调节性B细胞(regulatory B cell，Breg)是在机体免疫反应中起负调节作用的一类B细胞，并可通过细胞因子的分泌及细胞表面分子间的相互作用介导免疫反应的负调节，有研究表明其免疫能力主要由其所分泌的白介素10(interleukin 10，IL-10)所介导[4-5]。CD1d(hi)CD5+CD19+Breg是Breg的亚群之一，已被报道在毒性弥漫性甲状腺肿[6]、原发性干燥综合征[7]等多种免疫性疾病中具有重要作用[5]。有研究报道称Breg与JIA的发生密切相关，但其是否参与JIA-U的发生还未见报道[8]。因此本研究通过检测JIA-U患儿外周血中CDld(hi)CD5+CD19+Breg水平，探究其在JIA-U中的变化及意义，以期为JIA-U的早期检测和判断疾病严重程度提供数据支持。

1对象和方法

1.1对象选取2018-04/2020-05本院确诊收治的JIA-U患儿95例作为JIA-U组，其中活动期43例，静止期52例。70例JIA患儿作为JIA组，其中活动期33例，静止期37例。另选同时期正常健康体检儿童75例作为对照组。根据JIA-U疾病严重程度评分：房水细胞或房闪阳性、睫状充血、虹膜黏连、角膜后沉着物、玻璃体有细胞或者视网膜病变各1分[9]。JIA-U及JIA纳入标准：符合青少年JIA国际风湿病协会联盟(ILAR)分类标准[10]，JIA-U在此基础上接受常规眼科筛查评估确诊；临床资料完整；患儿未接受糖皮质激素等药物手段治疗；患儿均未患其它全身性免疫系统疾病。排除标准：患儿患有先天性心脏病、有过敏倾向等其他疾病。对照组纳入标准：既往身体健康且健康体检结果正常；排除标准：近期服用糖皮质激素或抗生素。所有受试者均通过本院医学伦理委员会批准，所有受试者及其家属知情同意并签署同意书。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器IL-10 ELISA检测试剂盒(货号：CK-E10155)购自武汉益普生物科技有限公司；藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)标记的鼠抗人CD1d抗体、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的鼠抗人CD5抗体、多甲藻素叶绿素蛋白(peridininchlorophyll- protein，PerCP)标记的鼠抗人CD19抗体、IgG1-PerCP-cyTM(货号：550255、555352、561295、550795)购自BD Biosciences；鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE(货号：sc-2855、sc-2866)购自Santa Cruz Biotechnology；RPMI Medium 1640、胎牛血清(货号：BL1098、ZCNXQ03-KIL)购自北京百奥莱博科技有限公司。Thermo赛默飞世尔Multiskan FC酶标仪购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；CytoFLEX流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。

1.2.2样品采集及CD1d(hi)CD5+CD19+Breg检测患儿于就诊当日抽取静脉血4mL，健康体检儿童抽取等量静脉血，肝素钠抗凝一部分离心取血浆，一部分密度梯度离心法分离单个核细胞，5min，1500r/min离心弃上清，PBS两次洗涤后再次用PBS重悬细胞调整浓度为1×106/mL，吸取100μL，加入CD1d-PE、CD5-FITC、CD19-PerCP各10μL混匀，而每个样本的同型对照加入IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP-cyTM各10μL，30min室温避光孵育后加入红细胞裂解液混匀静置15min，于流式细胞仪检测并用Cell Quest软件进行分析。

1.2.3ELISA检测IL-10水平取1.2.2中血浆标本根据IL-10 ELISA检测试剂盒说明书处理样本，在450nm处检测OD值，计算血浆IL-10水平。

2结果

2.1一般资料三组受试者年龄、性别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，与JIA组相比，JIA-U组JIA病程、JIA亚型差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组一般资料比较

2.2各组外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例变化对照组、JIA组、JIA-U组患儿外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例分别为(2.64±0.72)%、(1.96±0.35)%、(1.31±0.20)%，差异有统计学意义(F=174.176，P<0.01)；与对照组相比，JIA组、JIA-U组患儿外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与JIA组相比，JIA-U组CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。与静止期相比，活动期JIA及JIA-U患者CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 活动期与静止期JIA及JIA-U患者外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例比较

图1 流式细胞仪检测各组外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的比例结果 A：CD19设门图；B：对照组；C：JIA组；D：JIA-U组。

2.3各组IL-10的表达情况对照组、JIA组、JIA-U组患儿血浆中IL-10水平分别为20.33±5.16、31.22±4.79、43.35±6.74pg/mL，差异有统计学意义(F=339.327，P<0.01)；与对照组相比，JIA组、JIA-U组患儿血浆中IL-10水平显著增加，差异均有统计学意义(P<0.01)；与JIA相比，JIA-U组IL-10水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与静止期相比，活动期JIA及JIA-U患者IL-10水平显著增加，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 活动期与静止期JIA及JIA-U患者外周血IL-10的表达比较

2.4JIA-U患儿CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例与IL-10的相关性JIA-U患儿CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例与IL-10呈负相关(r=-0.377，P<0.01)，见图2。

图2 JIA-U患儿CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例与IL-10表达的相关性。

2.5CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例与JIA-U患者病情严重程度评分的相关性CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例与JIA-U患者病情严重程度呈显著负相关(r=-0.225，P=0.028)，见图3。

图3 CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例与JIA-U患者病情严重程度的相关性。

2.6Logistic回归分析影响因素JIA-U发生的因素选取上述检测指标中存在显著性差异的指标作为自变量，对CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例、JIA亚型、关节炎病程、IL-10水平进行Logistic回归分析发现，四者均对JIA-U发生存在影响(P<0.05)。多因素分析发现，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg低比例、JIA少关节型、关节炎病程<4a、IL-10高水平均是影响JIA-U发生的危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 Logistic回归分析影响JIA-U发生的因素

3讨论

JIA具有与慢性炎症性关节炎相同的症状，而葡萄膜炎是JIA的最常见的关节外表现，是一种常见的眼部炎症性疾病，其特征是虹膜、脉络膜、视网膜等部位出现炎症症状，解剖学将其分为前葡萄膜炎、中葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎，并且在慢性前葡萄膜炎发作时可能无症状表现，若不能得到及时有效的治疗，可导致患儿失明[2，11-13]。因此JIA-U的早期检测和治疗对患者的健康十分重要。

B细胞在自身免疫疾病的发生机制中具有重要作用，可通过产生抗体或呈递抗原促进T细胞活化，除此之外，还可通过促进炎症因子的分泌或抑制T细胞增殖来调节免疫功能[14]。Breg是一类仅可以通过分泌IL-10发挥其免疫抑制功能的B细胞，CDld(hi)CD5+CD19+是Breg的其中一个表型，研究表明其数量、功能的异常是自身免疫疾病发生的重要机制[15-16]。有研究学者将能够分泌IL-10的CDld(hi)CD5+B细胞亚群称为B10细胞[16]。许多研究发现，Breg在类风湿性关节炎[16]、JIA[17]等关节炎疾病中具有重要作用，并参与其发生发展。如产生IL-35的B细胞(i35-Bregs)可治疗葡萄膜炎等自身免疫或传染性疾病[18]。CD19+CD24hiCD38hiBreg在JIA患儿外周血中比例与健康对照组相比显著降低[17]。IL-10是一种免疫抑制因子，可通过抑制促炎因子的产生及T细胞活化达到抑制炎症反应的作用[19]。研究发现，在JIA患儿中IL-10水平在统计学中显著增加，这与IL-10的基因多态性有关，如：IL-10-1082 AA基因变体与多关节青少年特发性关节炎(pJIA)的易感性之间存在显著正相关性[20]。有学者发现自身免疫性葡萄膜炎模型大鼠血清中IL-10含量显著高于对照组，二者的含量升高可能是机体自然恢复机制的作用[19]。JIA-U患儿血清中IL-10水平高于JIA患者，其水平升高是眼部炎症的危险因素[21]。本研究发现与对照组相比，JIA组、JIA-U组患儿外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例依次显著降低，而IL-10水平依次显著增加，与前人研究结果相一致，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例与IL-10表达及JIA-U患者病情严重程度呈显著负相关关系，该结果表明CD1d(hi)CD5+CD19+Breg参与JIA-U的发生发展，IL-10水平的升高可能是由T淋巴细胞等其他免疫细胞所分泌，该机制与机体自身免疫功能的恢复有关。而本研究进一步探究结果发现，与静止期相比，活动期JIA及JIA-U患者CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例显著降低，IL-10水平显著增加，该结果表明，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg比例随着疾病活跃程度增大而降低，而IL-10水平随疾病活跃程度增大而增多。

研究显示，发病年龄≤6岁、关节炎病程<4a、少关节型是造成JIA-U发生的危险因素[22]。而本研究多因素分析发现，除了关节炎病程、关节亚型是影响JIA-U发生的危险因素外，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg低比例、IL-10高水平也是影响JIA-U发生的危险因素，与前人研究结果部分一致。这表明，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg的数量异常可能与JIA-U的发生有关，该结果为JIA-U的早期检查提供了一个潜在的监测指标，而发病年龄未纳入危险因素这点与前人研究存在差异可能是因为纳入病例数量欠缺所造成的。

综上所述，CD1d(hi)CD5+CD19+Breg在JIA-U患儿外周血中比例显著降低，其可能参与JIA-U的发生发展，有作为JIA-U疾病早期监测及严重程度判断检测指标的潜能。本研究不仅为JIA-U的早期检测和判断疾病严重程度提供了有价值的数据支持，还为其靶向治疗研究提供了参考。但由于病例样本量的局限，研究可能出现一些统计缺陷，因此，在未来的研究中会进一步扩大样本量。