基于CANON系统颗粒污泥耦合生物膜工艺脱氮性能及微生物特征研究

韩 松，李 凯*，王志康，任治军，李雪莹

（1.贵州民族大学生态环境工程学院，贵阳 550025；2.国家民委重点实验室：喀斯特环境地质灾害防治实验室，贵阳 550025）

近年，我国经济及工业体系迅速发展，垃圾渗滤液、食品加工废水、畜禽养殖废水等高浓度氨氮低碳废水排放逐年增加[1]。目前常用传统处理技术如活性污泥、A/O、A2/O等工艺处理高氨氮低碳废水，需大量曝气与有机物的额外投加，成本高，构筑物结构复杂，占地面积大，操作难度高。自养脱氮工艺又称CANON工艺，是基于上述情况研发的一种新工艺，在处理高浓度氨氮低碳废水时，具有物料投加少、能耗低、占地面积小、操作简单等优点[2]。

CANON工艺主要包括亚硝化和厌氧氨氧化（Anammox）两个阶段：I，进水中部分氨氮参与亚硝化反应，被氨氧化菌（AOB）依次转化为NH2OH、NO、NO2-；II，亚硝化反应生成NO2-与进水中剩余NH4+在厌氧氨氧化菌（AnAOB）作用下，发生Anammox反应生成N2与少量NO3-，由此实现氮去除。AOB与AnAOB是CANON工艺主要功能微生物，均为化能自养型，在脱氮过程中无需消耗碳源，无需NO2-进一步氧化为NO3-。研究表明，CANON工艺可节省约60%耗氧量与100%有机碳投加，减少90%污泥产量，是一种节能、经济的脱氮工艺[3]。

目前，对CANON工艺研究主要集中在单一生物膜系统与颗粒污泥系统实验室研究[4]，利用其颗粒污泥和生物膜空间特点，为AOB和AnAOB分别提供好氧和厌氧微环境，实现协同脱氮。生物膜由约10%微生物与约90%胞外聚合物（EPS）构成，EPS作为生物膜骨架提供稳定支撑并介导微生物表面黏附，形成AOB在外层好氧空间、AnAOB在内层厌氧空间的黏性三维结构[5]，可为微生物创造稳定生存环境，在细胞缺乏营养物质时，充当底物供细胞存活，使生物膜具有较强抗逆性，但过量EPS导致生物膜渗透性降低，影响膜内微生物活性[6]。相对而言，颗粒污泥主要构成为微生物，EPS在其形成过程中仅起黏合剂作用，具有较高污染物去除效率[7]，存在启动周期长、操控条件高、脱氮不稳定等问题[8]。探索将生物膜、颗粒污泥耦合实现自养脱氮，对于CANON工艺工程应用具有重要意义。

本文基于CANON系统EGSB反应器构建颗粒污泥生物膜复合式（GSBR）反应器，EGSB反应器也叫膨胀颗粒污泥床，在此基础上，EGSB反应器内三相分离器上添加软性填料形成生物膜，接种颗粒污泥与活性污泥混合液，构建成GSBR反应器。研究进水NH4+-N浓度、DO浓度、上升流速对脱氮效率与系统稳定性影响，探讨颗粒污泥与生物膜在复合系统工艺同步驯化情况、微观形态与微生物构成，探究GSBR反应器协同脱氮过程，研究可为CANON工艺工程应用研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 GSBR反应器

反应器如图1所示，主体可分为生物膜区和颗粒污泥区两部分，由三相分离器分隔开，三相分离器内投加软性填料供微生物附着生长。反应器高1.8 m，有效容积为8 L，生物膜区内径为150 mm，颗粒污泥区内径为50 mm。生物膜区和颗粒污泥区间设有曝气器。主体外侧设置恒温水浴加热器，主体底部设置进水口，上部设置出水口与回流口，进水管与回流管均连接蠕动泵。

图1 GSBR反应器装置Fig.1 GSBR Reactor

1.2 试验用水与接种污泥

采用人工废水，以NH4HCO3作为废水氮源，适量KH2PO4作为磷源，适量CaCl2促进颗粒污泥形成，使用NaHCO3调节废水pH，控制在7.8～8.2，接种污泥取自EGSB反应器中颗粒污泥与活性污泥混合液，接种量为0.05 L，MLSS为3 500 mg·L-1，进水按1 mL·L-1加入以下微量元素液：EDTA 5 g·L-1,CoCl2·6H2O 1.6 g·L-1,ZnSO4·7H2O 2.2 g·L-1，CuSO4·5H2O 1.2 g·L-1,MnCl2·4H2O 5.1 g·L-1，(NH4)6Mo7O244H2O 1.1 g·L-1，FeSO4·7H2O 5 g·L-1，CaCl2·2H2O 5.5 g·L-1。

1.3 反应器运行调控

采用上流式连续进水，通过蠕动泵调节进水与回流流速，调控颗粒污泥区上升流速，恒温加热器控制温度为（30±2）℃。将曝气器置于生物膜区与颗粒污泥间，调节曝气量控制DO浓度。实验中反应器共运行262 d，各阶段时间、进水NH4+-N浓度、DO浓度、上升流速、HRT参见表1。

表1 反应器运行情况Table1 Reactor operation

1.4 常规测试方法

NH4+-N、NO2--N、NO3--N和MLSS等采用标准方法测量，如表2所示。

表2 分析项目与检测方法Table 2 Analysis items and test methods

使用JPB-607AB便携式溶氧仪测定DO，使用PHBJ-260便携式pH计测定pH，使用HYL-2080激光粒度仪测定污泥粒径。

1.5 分析方法

1.5.1 总氮、氨氮去除效率

本研究中，总氮（TN）浓度由含氮物NH4+-N、NO2--N、NO3--N之和表示。氨氮去除率与总氮去除率（ETN）分别表示进、出水中NH4+-N与TN减少量与进水浓度比值，分别采用式（1）与（2）计算，公式如下：

式中，NH4+-Ninf,TNinf分别表示反应器进水中氨氮浓度与总氮浓度（mg·L-1）；NH4+-Neff,TNeff分别表示出水氨氮浓度与总氮浓度（mg·L-1）。

1.5.2 颗粒污泥粒径

在反应器上、中、下3个排泥采样口分别取10 mL泥水混合物，混合均匀后去除上清液，将10 mL纯泥样使用HYL-2080激光粒度仪测定污泥直径，计算接种初期和反应后期颗粒污泥粒径变化。

1.5.3 微生物多样性

取0.5 g生物膜、颗粒污泥样品，使用Fast DNA SPIN试剂盒提取基因组DNA，采用上海生工Illumina Miseq测序平台分析16s RNAV3区基因序列，所用扩增引物为341F:CCTACGGGNGGCWGCAG，805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC。基于97%同源性对OTUs进行聚类分析，通过与RDP（Ribosomal database project）在线数据库比对，分析微生物组成。

1.5.4 去除负荷

分别采用式（3）、式（4）计算NH4+-N单位容积去除负荷、TN单位容积去除负荷，公式如下：

2 结果与分析

2.1 进水NH 4+-N浓度对GSBR反应器脱氮的影响

进水NH4+-N浓度为50、100、150、200 mg·L-1，分别运行30 d，含氮物浓度及脱氮性能如图2所示。当进水NH4+-N浓度为50 mg·L-1时，出水中含氮物主要为NO3--N，NH4+-N、NO2--N浓度较低，不足0.2 mg·L-1；当进水NH4+-N浓度提升至200 mg·L-1时，NH4+-N、NO2--N浓度分别增至33.42 mg·L-1、17.28 mg·L-1。结合自养脱氮过程表达式，可推测主要脱氮途径为亚硝化-Anammox。NH4+-N去除率（ENH4+-N）及TN去除率（ETN）在进水NH4+-N浓度50～200 mg·L-1范围内提高而降低，由99%降至83%，ETN由76%降至61%，单位容积TN去除负荷（FrTN）由0.58 kgN(m3·d)-1升至1.76 kgN(m3·d)-1，表明含氮污染物去除量随进水NH4+-N浓度提升而增加。当进水NH4+-N提升至150 mg·L-1时，此时ETN、FrTN分别为72.6%、1.58 kgN(m3·d)-1，脱氮性能较好，进一步提升总氮去除增量显著减少，TN去除率下降。

图2 含氮物质浓度及TN去除率变化Fig.2 Changeof nitrogen content and TN removal rate

2.2 DO浓度对GSBR反应器脱氮的影响

进水NH4+-N浓度分别为50、100、150 mg·L-1，各阶段分别调控DO浓度为0.3、0.8、1.3、1.8 mg·L-1，出水NH4+-N、TN去除率及进水NH4+-N 100 mg·L-1时出水状况见图3。不同进水NH4+-N浓度，ENH4+-N均随DO浓度提升呈先增再降，在DO浓度为0.8 mg·L-1时整体去除率较好。原因是低氧条件下DO促进亚硝化，降解NH4+-N生成NO2--N；当DO浓度＞0.8 mg·L-1时，则抑制Anammox反应，影响NH4+-N转化为N2。以进水NH4+-N浓度为100 mg·L-1时为例，出水中NO2--N随DO升高而增加，原因是DO促进亚硝化生成NO2--N，NO3--N受DO浓度影响较小，NO3--N浓度先由24.3 mg·L-1上升至30.7 mg·L-1，随后回落至27.0 mg·L-1，变化幅度较小。

图3 NH 4+-N、TN去除率/含氮物质浓度Fig.3 Change of NH 4+-N、TN removal rate/nitrogen content

2.3 上升流速对GSBR反应器脱氮的影响

控制进水浓度为100 mg·L-1，调节回流泵转速控制颗粒污泥区、生物膜区料液上升流速，颗粒污泥区为3.5、5.0、6.5、8.0 m·h-1，生物膜区对应上升流速为0.9、1.3、1.6、2.0 m·h-1。运行参数：DO 0.8 mg·L-1、HRT 24 h，各阶段运行时间为20 d，反应器出水如图4所示。如图4所示，颗粒污泥区上升流速由3.5 m·h-1逐渐升至8.0 m·h-1，各阶段反应后期NH4+-N去除率呈先升后降，颗粒污泥区上升流速为6.5 m·h-1达最大值97.6%。TN去除率则随上升流速增加逐渐降低，颗粒污泥区上升流速3.5 m·h-1达最大值71.5%，污泥区上升流速提升5.0 m·h-1时快速降至59.1%，随上升流速进一步提升而缓慢下降。上升流速提升过程中，NH4+-N浓度先降后升，上升流速6.5 m·h-1时达最小值，表明上升流速在3.5～6.5 mg·L-1范围增加有利于亚硝化，促进NH4+-N向NO2--N转化，但不利于Anammox，抑制NH4+-N、NO2--N转化为N2，导致逐渐升高，ETN逐渐降低。当上升流速继续升至8.0 m·h-1时，亚硝化与Anammox均受不同程度抑制，NH4+-N、TN去除性能降低。

图4 NH 4+-N、TN去除率Fig.4 NH 4+-N、TN removal rate

2.4 微生物形态及组成

2.4.1 颗粒污泥粒径变化

如图5所示，为颗粒污泥粒径变化，接种前污泥粒径主要分布区间为0～3.0 mm，占颗粒总体数量比例为84%，其中，1.0～2.0 mm为含量最高分布区间，占比为38%，接种前颗粒污泥平均粒径为1.8 mm。接种污泥后粒径主要分布区间为2.0～4.0 mm，所占比例为79%，2.0～3.0 mm为含量最高分布区间，接种污泥后颗粒污泥平均粒径为2.7 mm，相对于接种前颗粒污泥平均粒径增加50%，平均体积增加2.4倍，表明GSBR反应器可有效实现颗粒污泥驯化。

图5 颗粒污泥粒径变化Fig.5 Change of particle size of granular sludge

2.4.2 污泥表观形态

如图6所示，为生物膜与颗粒污泥SEM电镜扫描图。生物膜与颗粒污泥污泥表面均有大量EPS结构，相比于颗粒污泥，生物膜表面结构较松散，覆盖EPS更多，存在较大孔道，用于膜内微生物与基质溶液间物质传递；颗粒污泥表面则相对紧实，絮状体、空隙相对较少，该结构可能受长期水力剪切影响，松散结合型EPS被冲刷而紧密结合型EPS相对含量增加。

图6 GSBR反应器污泥电镜扫描Fig.6 SEM of sludge in GSBR reactor

2.4.3 微生物多样性

如图7所示，为GSBR反应器污泥在种属水平上的多样性。生物膜优势菌种属为Nitrospira,norankf-BSV26,Candidatus-Brocadia,Denitratisoma,Meiothermus,norank-f-Gemmatimonadaceae,Nitrosomonas，相对丰度分别为13.39%、17.45%、4.31%、4.86%、7.93%、5.48%、2.37%。颗粒污泥优势菌属为Candidatus-Jettenia,norank-f-BSV26,Candidatus_Brocadia,Denitratisoma，norank-o-SBR1031，norank-c-OM190，相对丰度分别为18.38%、2.79%、3.70%、2.77%、11.20%、3.90%。其中，Candidatus-Brocadia和Candidatus-Jettenia为AnAOB，Nitrosomonas为亚硝化细菌，Nitrospira为硝化细菌[9]。

图7 GSBR反应器污泥在属水平的微生物组成Fig.7 Microbial composition of GSBR reactor sludgein generic level

3 讨 论

本研究GSBR反应器，当进水NH4+-N负荷较低时，亚硝化-Anammox途径将NH4+-N完全转化为大量N2与少量NO3--N，当进水NH4+-N负荷较高时，亚硝化-Anammox无法将NH4+-N、NO2--N完全转化，导致出水中NH4+-N与NO2--N浓度较高。Li等采用SBR运行CANON生物膜系统，最大FrTN为0.42 kgN(m3·d)-1至0.59 kgN(m3·d)-1[10]；采用自养脱氮颗粒污泥系统，最大FrTN可达2.30 kgN(m3·d)-1[11]。本文最大FrTN为1.76 kgN(m3·d)-1，接近颗粒污泥系统。张泽宇等采用最佳策略调控CANON颗粒污泥系统，进水NH4+-N浓度变化最短适应时间为25 d[12]，反应器适应期为7～12 d，相对颗粒污泥系统较短，抗冲击负荷性能更优。不同进水NH4+-N浓度时，ENH4+-N与ETN均随DO浓度在0.3～1.8 mg·L-1范围提高，呈先增后降趋势，均在DO浓度为0.8 mg·L-1达整体脱氮效率最高，与方芳等研究结果一致[13]。研究认为，DO是实现CANON工艺高效运行重要因素，保证AOB能够将部分NH4+-N转变成NO2--N，但DO过高又促进NOB生长导致NO2--N生成NO3--N，抑制AnAOB活性[14]。张姚等基于CANON颗粒污泥系统研究则显示，在DO为0.46 mg·L-1时，当DO＞1.0 mg·L-1时Anammox菌失活[15]。本文GSBR反应器对DO耐受性更强，适应范围更大，GSBR反应器脱氮过程中受DO影响程度小，以进水NH4+-N浓度100 mg·L-1为例，DO为0.8 mg·L-1时TN去除率达最大值66.1%，DO为1.8 mg·L-1时为51.1%，降幅仅为15%。部分研究显示，自养脱氮颗粒污泥系统在上升流速为6～7 m·h-1时性能最佳[16]。本文最适上升流速相对较低，降低能耗需求，可能是上升流速综合作用于生物膜与颗粒污泥的结果。研究认为，上升流速形成水力剪切，影响颗粒污泥与基质如DO传质过程，对颗粒污泥粒径、沉降性能及EPS生成造成影响[17-18]。

微生物形态组成表明，生物膜与颗粒污泥微生物组成差异显著，可能是因两者表面水体流速不同，导致EPS覆盖层厚度、DO及含氮物传质产生差异[19]。生物膜与颗粒污泥均含有功能微生物AOB、AnAOB，其中，AOB主要分布在生物膜中，AnAOB在生物膜与颗粒污泥中均有较多分布，尤其在颗粒污泥中，AnAOB丰度高达22%，远高于其他优势物种，这是因颗粒污泥主要构成为微生物，EPS在其形成过程中仅发挥黏合剂作用，污泥在颗粒污泥表面富集，污泥消耗大部分氧气，使其内部低氧状态，AnAOB活性不受抑制[20]。生物膜中还检测出硝化功能菌Nitrospira，原因可能是生物膜长期附着于填料，增加污泥龄，系统对硝化功能菌的筛除能力减弱[21]。生物膜也因微生态系统多元化，具有更好抗逆性与抗冲击负荷能力。

4 结论

构建一种CANON工艺GSBR反应器，实现自养生物膜与颗粒污泥同步驯化，进水NH4+-N浓度、DO浓度、上升流速分别在150 mg·L-1、0.8 mg·L-1、3.5 m·h-1时脱氮性能较好。总氮去除负荷最高可达1.76 kgN(m3·d)-1，对水质波动适应期较短，进水NH4+-N浓度提升后7～12 d可恢复到稳定状态，具有较大DO耐受性及适应范围，受DO影响小，DO由0.8 mg·L-1增至1.8 mg·L-1，TN去除率仅降低23%。颗粒污泥平均粒径增加50%，平均体积增加2.4倍；生物膜与颗粒污泥微生物组成差异明显，AOB主要分布在生物膜中，AnAOB在生物膜与颗粒污泥中均有较多分布，颗粒污泥中丰度高达22%，不同微生物分布实现生物膜与颗粒污泥耦合脱氮。