神经内分泌前列腺癌裸鼠模型肿瘤进展中相关成纤维细胞基因表达变化的测序分析

谢 弘，傅 强，胡晓勇，张 炯，宋鲁杰，黄建文，杨 涛

(上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科，上海东方泌尿修复重建研究所，上海 200233)

前列腺癌为男性最常见的恶性肿瘤之一，目前雄激素剥夺治疗被临床广泛应用，为转移性前列腺癌治疗首选，但随时间进展往往会发展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。其中一部分患者出现雄激素受体非依赖性增殖，并伴有神经内分泌标志物阳性表达，这一过程表明前列腺癌出现神经内分泌化、侵袭能力增强等特征，目前该发病机制仍不清楚,且临床缺乏有效治疗措施，为前列腺癌患者预后不良的主要原因之一[1-3]。肿瘤微环境，尤以肿瘤相关成纤维细胞为代表，被认为是参与前列腺肿瘤发生发展的重要因素之一，在促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及参与肿瘤细胞免疫调节等方面扮演重要角色[4-6]。本研究建立神经内分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer，NEPC)移植裸鼠模型，通过转录组测序技术(RNA sequencing technology,RNA-seq)宏观分析比较在肿瘤种植后不同时期中肿瘤相关成纤维细胞基因的表达变化情况，为发现NEPC的肿瘤进展潜在机制作用靶标打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要动物模型及试剂实验动物BABL/c雄性裸鼠10只，4周龄，体质量约20～25 g，无特殊病原体(specific pathogen free，SPF)条件下饲养，由上海交通大学附属第六人民医院实验中心提供，生产许可证号：SCXK(沪)2008-0016，使用许可证号：SYXK(沪)2011-0128。动物实验伦理通过上海市第六人民医院动物福利伦理委员会审查并同意开展。

实验主要试剂为DMEM 培养基(美国 Gibco公司)、胎牛血清(美国 Gibco公司)、Trizol试剂盒(上海普飞公司)、M-MLV试剂盒(美国promega公司)。

1.2 新鲜前列腺癌瘤块种植方法NEPC裸鼠皮下移植瘤模型建立：方法同PRESNELL和GRAY等[7-8]的研究，留取NEPC新鲜手术病理组织，选择1 cm3瘤灶组织从中留取1 mm×1 mm肿瘤组织，用生理盐水清洗3次后备用。后用10 g/L的戊巴比妥钠，质量浓度为40 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，在裸鼠背部皮下做一小切口，将瘤块沿切口逐渐送入至距切口约1 cm处，每只裸鼠接种一个组织块，接种完成后缝合切口，整个接种过程在30 min内完成。

1.3 肿瘤相关成纤维细胞原代培养及传代根据李义峰等[9]的方法，分别在移植瘤模型造模成功后2周(2周组)及4周(4周组)处死裸鼠动物，获取前列腺癌获取新鲜组织后，确认取材迅速置入无菌D-Hanks液中，反复漂洗，用眼科剪将组织块剪成糊状，胰酶消化20～30 min，倒置显微镜下见大量悬浮的单个细胞和细胞团，即加入含20%胎牛血清(fetal calf seram,FCS)的改良Eagle培养基(dulbecco’s midified eagle medium,DMEM)液终止消化。加入5 μg/mL胰岛素+1 mg/mL FGF-2+5% FCS+DMEM液，置于37 ℃、5%CO2培养箱，72 h后首次换液，每3～4 d更换培养液传代一次。取第4～6代细胞用于后续实验。

1.4 RNA 提取和测序最终符合实验要求的小鼠且达到存活要求时间为2周组与4周组各2只，各分离成功肿瘤相关成纤维细胞株。肿瘤相关成纤维细胞接种分为两组：2周组与4周组，每组2个复孔，6 h后收集细胞，Trizol法提取总 RNA，并进行质量控制。按照美国 Illumina 生物技术公司RNA-seq样本制备试剂盒说明构建cDNA文库。对照基因组信息和完整的转录组信息，将测序出的reads比对到参考基因组上，进而对基因或转录本进行注释和定量。将 reads比对到基因组后，采用StringTie(2016)对表达进行注释和定量。StringTie应用网络流算法和可选的基因组denovo组装，将复杂的数据集组装成转录本。进一步计算基因和转录本的FPKM值(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragment，即每百万外显子片段碱基映射获得的基因表达)。

1.5 差异转录本分析利用Ballgown对两个不同处理组进行比较，得到P值、Q值和转录本间的差异倍数(fold-change)；本研究中将两组进行比较，进行差异基因筛选，筛选条件为P<0.05和Fold change>1.5倍及<0.66667倍。

1.6 GO 功能类别及KEGG通路富集分析GO 数据库(gene ontology)用树状分层的方式对基因及蛋白功能进行详细描述，阐明了基因功能之间的层次关系。并将基因功能分为分子功能(MF；molecular function)、生物学过程(BP；biological pathway)和细胞成分(CC；cellular component)3个类别。GO富集分析是基于GO数据库，对差异基因利用Fisher精确检验，将目标功能基因进行统计学分析，按照P<0.05进行筛选，筛选出显著性差异的功能基因。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因及其编码产物间关系、基因功能、基因组信息的数据库，信号通路分析(Pathway分析)是基于KEGG数据库，对差异基因利用Fisher精确检验，将目标基因参与的通路进行统计学分析，按照P<0.05进行筛选，筛选出显著性差异的信号通路。

2 结 果

2.1 RNA-seq 聚类分析结果由差异表达基因聚类热图(图1)可见，2周组与4周组两者对应的转录组存在表达差异，其中红色代表差异转录本在分组样本中表达值高，蓝色代表差异转录本在分组样本中表达值低。根据热图中可见似由差异基因表达火山图(图2)得到在两组对比中31 175个基因无差异化表达，24个差异表达基因，其中上调表达基因11个、下调表达基因13个。图2中横坐标表示基因在处理和对照两组中的表达倍数变化(log2FoldChange)，纵坐标表示基因在处理和对照两组中表达差异的显著性水平(-log10padj或-log10pvalue)，数值越大差异性越明显。

图中横坐标为组别,第二行中的1、2分别代表裸鼠序号；纵坐标为差异基因FPKM归一化后的数值，颜色越红，表达量越高；颜色越蓝，表达量越低。图1 差异表达基因聚类热图

图中蓝色的虚线表示差异基因筛选标准的阈值线：上调基因用红色点表示，下调基因用绿色点表示。图2 基因火山图

2.2 差异基因显著富集的GO分析结果根据差异基因的构建分布表(表1)，图中可见在分子功能(BP)、生物学过程(CC)和细胞成分(MF)3个类别基因中，改变功能基因主要富集于：SMAD蛋白磷酸化调控，血管新生抑制，脂蛋白代谢，细胞连接功能，多细胞功能稳态，前列腺上皮转化调控，BMP信号调控，间质-上皮转化调控，生长因子活性，半胱氨酸型内肽酶激活剂活性参与的凋亡过程，细胞因子结合等功能调控。

表1 GO富集分析表

续表1

2.3 差异表达基因的通路显著性富集分析结果由表2可见，通过 KEGG 数据库分析，表达变化基因明显富集于细胞外环境、肿瘤信号通路：细胞粘合通路、细胞外连接通路、TGF-beta信号通路、cAMP信号通路、钙通道通路、细胞因子及受体通路等，此外还与肿瘤转录失调通路、前列腺癌通路有关，说明肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤不同进展时期内可表现出细胞外基质信号及肿瘤相关信号通路的表达改变。

表2 KEGG富集分析表

2.4 定量 PCR 验证结果见图3。

图中横坐标为基因类别，纵坐标为2-ΔΔCt反映各样品相对正常组样品目的基因的相对表达水平，数值越高表达水平越高，各组基因表达组间t检验*P<0.01。图3 两组各基因qPCR验证箱图

由图3可见，通过对测序结果中肿瘤相关的差异表达基因 NKX3-1、ISM1、GREM1进行定量 PCR 验证，本次验证发现3个基因的表达趋势与测序结果完全一致，4周组较2周组在 NKX3-1、ISM1上的表达，均有显著的下降，GREM1表达有明显上升，且差异均有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

NEPC是CRPC中侵袭性较强、恶性程度较高的一种亚型[10]，其发生远处转移发生率约为4%～25%，远高于与其他类型的前列腺癌。NEPC提示预后不良，中位生存期约为7～10个月，5年存活率仅1%左右[11-13]。目前对NEPC发生发展的分子机制缺乏深入研究，相关患者的治疗仍基于铂类的化疗手段，因此我们有必要在NEPC的机制研究中下功夫，为该疾病的治疗提供有效可选择靶标。肿瘤微环境是研究肿瘤中不可或缺的一部分，其主要由肿瘤基质中各种细胞、结构分子及细胞因子的整体构成。在前列腺癌相关的研究中，主要以肿瘤相关的成纤维细胞以及细胞外基质的研究多见[4-5]。在肿瘤发展进程中，相关成纤维细胞可能通过不同的基因表达及错综复杂的信号网络，表现出对肿瘤促进和抑制的双重作用，以动态平衡的方式激活自身及产生肿瘤所需环境等方式参与其中。但这往往在模拟实验中难以准确监测，此时探寻环境中不同状态下的分子机制更为困难。综合上述，课题组初步采用建立NEPC移植裸鼠模型，通过转录组测序技术(RNA-seq)宏观分析比较在肿瘤种植后初探不同时期中肿瘤相关成纤维细胞基因的表达变化情况，并通过qPCR技术验证相关差异基因表达来尝试性研究肿瘤相关成纤维细胞在NEPC进展中所扮演的角色。

本研究通过RNA二代测序技术检测了裸鼠模型2周及4周时肿瘤相关成纤维细胞基因表达变化，结果发现随着时间的推移，相关细胞外基质结构、成分及其分泌的因子相关基因表达改变：血管新生抑制、脂蛋白代谢、细胞连接功能、多细胞功能稳态、前列腺上皮转化调控、BMP信号调控、间质-上皮转化调控、生长因子活性、细胞因子结合等功能调控基因发生变化。这也与肿瘤相关成纤维细胞被认为可以通过直接接触的方式、通过旁分泌的方式分泌多种细胞因子与肿瘤细胞相互作用的说法相吻合。前列腺癌微环境基质细胞对肿瘤细胞生长的促进作用是随着年龄增长而发生变化，老化的前列腺成纤维细胞能够通过旁分泌途径促进癌前及癌性上皮细胞的生长[14-15]。在肿瘤相关成纤维细胞老化与活化关联的进一步研究中发现，随着时间推移，成纤维细胞老化的刺激参与诱导成肌纤维细胞的分化，这在肿瘤进展中有促进作用[14-16]。也有研究从人体前列腺癌组织中分离出的表现为老化特点的肿瘤相关成纤维细胞似乎仍处于较为活化的状态[17]。本研究认为，在不同时间维度上NEPC肿瘤相关成纤维细胞基因表达存在差异，我们从24个差异性表达基因中选择被文献报道与肿瘤相关的3个基因来做PCR验证，结果发现以NKX3-1、ISM1基因为代表的相关通路基因在本研究中证实在4周组显著低于2周组，这可能是肿瘤病理进展中对前列腺癌抑制减弱、对肿瘤血管新生抑制减弱，导致前列腺癌生长加快，可能说明随着肿瘤进展的微环境中相关成纤维细胞保护因素被打乱[18-19]。在本研究中亦发现随着肿瘤进展GREM1基因的表达显著增加，推测其可能通过潜在通路诱导上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生，并促进肿瘤转移和生长[20]。

本研究探讨了NEPC相关成纤维细胞在不同时间维度上基因表达的作用机制，为后续深一步研究癌相关成纤维细胞基因在促进NEPC进展方面提供了系统性的实验基础，可能为相关机制研究及作用靶点提供一定的理论依据。本研究存在诸多不足之处，研究仍处于较为表浅的领域，仅为初步的探索式研究，样本量较少，在后续的研究过程设计中，我们将进一步扩大动物样本量规模，研究各个肿瘤进展时间节点的肿瘤微环境与肿瘤发展的相互参与、各个相关基因通路的相关性及相互作用，为进一步明确该类特殊类型肿瘤发生发展机制及其后期的诊治工作新思路、新策略打下基础。