450 nm蓝激光静态作用于猪膀胱壁组织的生物效应

刘国雄，徐晓峰，姜大力，王新阳，乔西民 ，贺大林，吴开杰

(1 西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061；2 咸阳市中心医院泌尿外科，陕西咸阳 712000)

随着医学激光技术的不断成熟以及医疗器械的更新换代，激光在各个学科中的应用日渐增多，并且逐渐获得了良好的治疗效果[1]。450 nm新型半导体蓝激光(下文中简称蓝激光)是自主研发的世界首创国产蓝激光手术设备，由于对血红蛋白对450 nm蓝激光能量有着更高效的吸收效率，因此该设备在汽化效率、热损伤范围、降耗降噪等各方面独具优势。300 nm蓝激光设备已获得批准，应用于包括膀胱肿瘤在内的腔道浅表病变切除手术[2-3]。

但蓝激光对不同组织的生物学效应可能不同，包括汽化切割和凝固止血效能，特别是在不同治疗模式(动态移动、静态作用)下存在差异，未来可能影响其在外科手术中的具体应用。因此，积极在动物实验及离体活组织中测试不同治疗模式和参数，进一步研究蓝激光对各脏器、组织的生物效应，探索最佳的、安全的治疗参数，包括作用功率、作用距离及作用时间，可能为其在临床上膀胱肿瘤手术中的安全应用提供扎实的理论基础。

本研究选取猪膀胱壁作为实验对象，旨在模拟蓝激光在膀胱肿瘤手术中的应用场景，着重研究在静态作用模式下蓝激光作用方式，探索蓝激光-膀胱组织的生物学效应，为后续总结蓝激光在膀胱肿瘤切除术中精准切除肿瘤、严密止血应用的技巧、避免对正常膀胱壁产生影响打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料西安近郊屠宰厂购买新鲜的猪膀胱组织(实验当天凌晨1～2时取材)，切成约5 cm×7 cm大小，暂存于4 ℃冰箱待用。采用多点测量法测量膀胱组织厚度。蓝激光手术系统由西安蓝极科技有限公司研制并生产，波长为450 nm，其光纤末端输出功率为0 ～30 W，功率连续输出，可调节；光纤直径800 μm，光纤长度3.0 m。输出方式：连续输出；操作方式：通过脚踏开关控制激光发射并持续时间，通过触屏调节功率、频率大小。其他实验仪器有光学显微镜(奥林巴斯，日本)和游标卡尺。病理切片、染色由西安交通大学第一附属医院病理科完成。

1.2 实验方法将制备好的膀胱壁组织置于承载盒中，连接光纤与蓝激光手术系统主机，将光纤安置于步进机上(图1)，开启激光器，设置激光参数。以37 ℃生理盐水为介质，对膀胱组织进行定点汽化。

步进机可调整光纤至膀胱组织的距离，组织承载平台可使膀胱组织处于自然平整状态。图1 步进机及组织承载平台照片

设置照射时间为1 s，作用功率为5、10、20、30 W，调试步进机使得光纤头距离膀胱组织分别为0、1、2 mm,结束后拍摄整体图，使用游标卡尺测量并记录汽化(凝固)宽度，同时肉眼观察膀胱黏膜及对侧膀胱浆膜层改变情况。使用体积分数为4%的多聚甲醛固定标本，待组织固定好后，使用锋利刀片对组织进行横向全层切开，观察同一工作距离、不同工作功率条件下蓝激光的作用效果，并用游标卡尺测量并记录汽化(凝固)深度。进行各浓度酒精脱水、不同浓度二甲苯溶液脱酒精、蜡杯浸蜡、包埋等步骤，将包埋好的组织块送至病理科进行切片及苏木素-尹红染色，在奥林巴斯光学显微镜下观察膀胱黏膜损伤的形态结构，测量汽化宽度、深度及热损伤范围。

进一步设置照射时间分别为2、3、5、7、10 s,其余具体操作步骤与前面方法中提到的一致。每一步结束后做好拍照、测量及记录，通过肉眼和光学显微镜观察并记录不同条件下蓝激光作用膀胱组织所产生的生物效应。所有实验数据均进行3次测量，结果取各测量值的均数。

1.3 数据和图片处理数据处理使用SPSS 18.0软件，图片处理使用Photoshop CS5。

2 结 果

光纤贴近膀胱组织时光斑直径为0.87 mm；作用距离为1、2 mm的光斑直径分别为1.26、1.76 mm。不同功率和作用时间及作用距离下，我们观察到了蓝激光作用于膀胱组织产生的不同效应。

2.1 凝固效应如图2、表1所示，450 nm 蓝激光功率为5 W、在照射猪膀胱组织1 s后产生的组织效应不明显，未见明显的汽化效果和碳化产生；功率为10～30 W、作用时间在1 s时，产生凝固效果。相同功率下作用距离为0～2 mm时，距离越近凝固范围和深度越大。所产生的凝固宽度0.82～2.83 mm，凝固深度为1.89～3.69 mm。功率5 W及以上、作用时间为2 s及以上时，即刻产生凝固效果，且随着激光功率增加、照射距离改变，膀胱黏膜表面出现了较为明显的白色凝固区域，同一作用距离下随着功率增加所产生的凝固范围增大、凝固层厚度增加，虽然膀胱黏膜表明产生凹陷，但未见汽化和碳化发生。保持激光功率不变，拉近作用距离1～2 mm，凝固范围和凝固层厚度也随着增加。

2.2 汽化效应与击穿如图3、表2所示，当功率为5 W，延长作用时间至5 s时，膀胱组织出现了汽化效应。随着作用时间的延长，汽化宽度和深度逐渐增加，但汽化效应和作用距离成负相关。整体分析得出激光光纤头贴紧组织进行汽化时汽化深度最大，而增加作用距离，作用深度减小、但宽度增加，汽化深度、宽度随作用时间、距离变化范围分别是1.3～8.85 mm(穿孔)和1.1～2.56 mm。在作用时间为5、7、10 s时，作用功率为20、30 W时，膀胱组织被击穿。此外，在实验过程中我们发现，在功率为30 W、作用距离为3 mm时，连续作用时间在5、7、10 s时，光纤会发生爆破声。

2.3 热损伤通过光学显微镜观察，450 nm蓝激光在膀胱组织汽化过程中产生了很小的热损伤范围。如图3A、B所示。在激光功率30 W、作用时间2 s和作用距离2 mm时，除汽化边缘黏膜产生范围约1 mm的凝固变性，其黏膜下层、肌肉层无明显凝固变性；图3B中膀胱组织被全层击穿，但在膀胱组织被汽化的边缘亦无明显的组织凝固变性现象。

2.4 病理图4显示了450 nm蓝激光对膀胱的生物效应的病理表现。

A、B、C、D、E、F：依次对应作用时间1、2、3、5、7、10 s；每幅小图激光作用点从左至右功率依次为5、10、20、30 W，由上至下作用距离分别为0、1、2 mm。图2 450 nm蓝激光对膀胱壁的生物效应大体图

表1 作用时间为1 s时，不同作用距离下5～30 W 450 nm 蓝激光对猪膀胱组织产生凝固效应 (/mm)

A、B、C、D:依次对应作用时间2、3、5、7 s；每幅小图激光作用点从左至右功率依次为5、10、20、30 W。图3 作用距离2 mm 时450 nm蓝激光对膀胱壁的生物效应剖面图

表2 作用时间为2～10 s时，不同作用距离下功率5～30 W时 450 nm 蓝激光对猪膀胱组织产生汽化效应的测量结果 (/mm)

A：功率30 W，作用距离2 mm，作用时间2 s；B：功率20 W，作用距离0 mm，作用时间5 s；图中“黑色标尺”表示1 000 μm。图4 450 nm蓝激光对膀胱壁的生物效应病理(HE,×20)

3 讨 论

激光组织作用效应与激光的波长、发射的模式(脉冲/连续)、功率、作用距离以及时间等有关。一项在肾脏组织的研究表明脉冲Tm∶YAG激光器比CW Tm∶YAG激光器产生的碳化更少，比Ho∶YAG激光器造成的创伤更小[4]。就穿透深度和凝固厚度而言，Nd∶YAG激光>绿光激>钬激光[5]。这主要与近红外波长激光以水吸收为主、可见波长激光以血红蛋白吸收为主有关。关于蓝激光-组织作用的生物学效应文献资料报道甚少，LINDEN等[6]于2016年报道了使用3 W蓝激光汽化组织的离体实验，在作用时间为1 s时，产生了宽约0.8 mm、深度约1.2 mm的长椭圆形组织缺损，汽化周围凝固层厚度约0.5 mm。另外，BRAUN等[7]于2017发表的研究显示使用波长为445 nm半导体蓝激光在猪下颌软组织进行移动汽化切割，汽化功率为2 W，作用距离为1 mm，光纤直径为320 μm，产生的汽化深度中位数为0.44 mm。GOBBO等[8]应用二极管蓝激光同近红外波长的二极管激光以及手术刀，进行了口腔黏膜增生病变切割治疗的对比研究，其中激光波长为445 nm、功率为2 W、光纤直径为320 μm，研究结果表明蓝激光热损伤范围为27.2～268.7 μm，而近红外光热损伤范围可达50.0～406.9 μm。

基于本研究团队前期自主研发的世界首创国产450 nm新型半导体蓝激光手术设备已获得批准，应用于包括膀胱肿瘤在内的腔道浅表病变切除手术，有必要了解在运动或静息状态下新型450 nm蓝激光在对膀胱病损进行手术时的安全性探索，即进一步通过在动物实验及离体活组织中测试不同治疗模式下蓝激光对膀胱壁组织的生物效应，以及最佳治疗参数。本研究采用静态汽化凝固模式下，在不同功率、照射时间和照射距离情况下，激光对膀胱组织的作用效果。一般情况下，凝固效应利于手术止血，建议在进行手术时，降低功率，根据需要调节光纤头至组织的距离，这样才能有效止血和最大程度地避免组织损伤。建议凝固止血时将功率调至10～ 15 W，并采用单踩脚踏进行止血，踩下脚踏时间建议1～2 s。

汽化效应有利于对目标组织进行切割，根据实验结果，本研究建议在对膀胱组织进行汽化切割时，为确保安全，务必要对目标点位进行有距离操作，且避免脚踏踩踏时间过长。建议汽化膀胱组织时可调节功率至20～30 W，作用距离调整至1～2 mm，脚踏踩下时间避免超过3 s，汽化切割过程中不可反复对同一位置进行激光照射，严防膀胱穿孔。

本研究首次采用静态作用模式下评估新型450 nm蓝激光对猪膀胱组织的生物学效应，包括凝固效应和汽化效应，初步得出了在静态作用模式下，蓝激光的安全范围，包括激光功率范围、照射时间以及照射距离等作用参数，这可为国产创新蓝激光在治疗包括膀胱肿瘤等膀胱腔内病变的推广应用提供扎实的理论基础。