天马颗粒对结肠直癌细胞中FLI-1 启动子甲基化影响

王华帅，武明胜，李一金，谢 彪，罗 敏，何永恒*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院肛肠科，湖南 长沙 410006；3 湖南中医药大学第二附属医院肛肠科，湖南 长沙 410005）

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，也是世界上第三大最常见的恶性肿瘤[1]。据统计，2018 年全球新发癌症病例总数为1810 万例，癌症死亡人数为960 万人。其中，结直肠癌占总病例的6.1%，占总癌症死亡人数的9.2%[2]。 我国《2019 年全国癌症报告》指出，结直肠癌依然是我国主要的恶性肿瘤之一，仅次于肺癌和胃癌。 国内外研究一致认为，结肠癌会造成沉重的社会和经济负担[3-4]。 目前，认为其发病涉及疾病、肠道菌群、遗传、年龄和表观遗传等因素。现代临床治疗结直肠癌常采用手术、放化疗等方法，术后患者仍然面临着生存质量低、复发转移率高、药物抵抗等不良反应，中医药治疗结直肠癌具有抗复发转移、提高免疫力、减轻放化疗不良反应及延长生存周期等独特优势。

何永恒教授结合化痞膏、黄芪益损汤、内消瘰疬丸三方化裁而研制成天马颗粒，具有“拔癌毒，消结肿，通经络，止疼痛”功效，具备“攻、解、化、散、托”法的科学内涵。 经过多年临床运用及实验研究[5-13]，天马颗粒组方得到不断优化，现已获得专利[14]。前期研究发现，FLI-1 在结直肠癌中是个抑癌基因，其表达受启动子甲基化影响，去甲基化作用后可使其过表达，抑制结直肠癌细胞增殖[15]。DNA 甲基化主要由甲基化转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）和S-腺苷甲硫氨酸催化。 而DNMT1、DNMT3a 是DNMT主要组成。 本实验在前期研究基础上，以HCT116、HT29、Caco-2 细胞为研究对象，观察天马颗粒血清对FLI-1 蛋白表达的影响， 探究对FLI-1 启动子甲基化作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及动物

人结直肠癌细胞HCT116、HT29、Caco-2 细胞株购自武汉procell 公司，批号CL-0096、CL-0118、CL-0050；8 周龄SD 雄性大鼠20 只，体质量（200±20) g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证：430727201101275856，伦理编号：LLBH-202010130001。

1.2 主要药物及试剂

天马颗粒购自湖南中医药大学第二附属医院（批准号[湘]卫药剂9706024），规格10×10 g/包，用法：成人1 包/次，2 次/d。将上述药物加水加热30 min，使药物溶解，过滤；在残渣中继续加水加热30 min，过滤，重复操作，使得药物充分溶解，合并滤液，混合浓缩制备成含药质量浓度为0.09 g/mL 的药液，灭菌后置于4 ℃冰箱保存。

DNMT1、DNMT3a 检测试剂盒（美国Abcam 公司，批号：ab113470、ab113469）；FLI-1 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号：A5644）；actin 抗体（美国proteintech 公司，批号：66009-1-Ig）；mRNA逆 转 录 试 剂 盒、UltraSYBR Mixture、DM2000 Plus DNA Marker（中国北京康为世纪公司，批号：CW2569、CW2141、CW2601、CW0632）；DEPC、Tris（美国Sigma公司，批号：D5758-25ML、V900483）；Trizol（美国Thermo 公司，批号15596026）；核酸染料（中国北京普利莱公司，批号：PB11141）；BCA 蛋白试剂盒（长沙艾碧维生物科技有限公司，批号：CW0014S）。

1.3 主要仪器

台式冷冻离心机(中国湖南湘仪公司，型号：H1650R)；荧光PCR 板、荧光定量RCP 仪(美国Thermo 公司，型号：PIKOREAL96、SPL0960)；电泳仪、水平琼脂糖电泳槽（中国北京六一公司，型号：DYY-2C、DYCP-31DN）；旋涡混合器（中国江苏其林贝尔公司，型号：GL-88B）；全自动酶标洗板机、多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，型号：PW-812、MB-530）。

1.4 细胞培养

HCT116、HT29 细 胞 株 采 用McCoy′s 5A+1%青-链霉素双抗培养基，Caco-2 细胞采用MEM 培养基+1%青-链霉素双抗培养基，在37 ℃，5% CO2的条件下常规培养。

1.5 动物血清制备

将20 只SD 雄性大鼠随机分为2 组，中药组和空白组，每组10 只。 中药组按照人-动物体表面积关系换算出大鼠每日中药等效剂量1.86 g/kg，给予相应中药药液灌胃，2 次/d；空白组予以等容量的灭菌水灌胃。 连续给药7 d，末次灌胃1 h 后，采用腹主动脉采血法，离心、提取血清、过滤、灭活补体，保存在-20 ℃的冰箱中备用。

1.6 分组

将每种结直肠癌细胞分为3 组：Blank 组、NC组、TMKL 组，Blank 组为空白对照，NC 组予以空白血清干预，TMKL 组予以天马颗粒血清干预。

1.7 CCK8 筛选天马颗粒血清最佳干预浓度

以5×103/mL 细胞密度接种至96 孔培养板中，用冷培养液将细胞同步化处理后，分别加入胎牛血清、空白血清和天马颗粒血清，每组设置5%、10%、15%、20%，每组均设3 个复孔。待分别干预处理24 h后，吸弃上清，每孔加入10 μL CCK8 溶液及90 μL完全培养基，培养箱中孵育2 h。 使用酶标仪测定450 nm 处OD 值。 细胞增殖率=[（对照孔OD 值-实验孔OD 值）/对照孔OD 值]×100%。

1.8 Western blot 检测FLI-1 蛋白相对表达

将分组处理过的细胞进行胰酶消化，4500 r/min离心5 min，离心半径17.8 cm，去上清液，加入裂解液，冰上裂解30 min，配制BSA 浓度梯度标准液及BCA 工作液，在进行蛋白质定量分析后，进行蛋白电泳，电泳条件为90 V，30 min 后转120 V，然后进行转膜，封闭2 h 后在4 ℃条件下孵育一抗FLI-1(1∶1000)和内参β-actin(1∶5000)孵育过夜，洗膜后加入HRP 标记的二抗(1∶10 000)，采用化学发光剂显影，Image J 软件进行灰度分析。

1.9 qPCR 检测FLI-1 mRNA 表达

使用Trizol 法提取各组细胞中的总RNA，测定RNA 浓度后，逆转录合成cDNA。按照试剂盒说明书进行实时定量PCR 检测。 运用2-ΔΔCt方法进行数据分析。 引物设计见表1。

表1 PCR 引物序列

1.10 ELISA 检测DNMT1、DNMT3a 蛋白

根据ELISA 试剂盒说明书，对分组处理后的细胞进行DNMT1、DNMT3a 蛋白含量检测。

1.11 MSP 检测FLI-1 启动子甲基化

根据基因组DNA 提取试剂盒说明书，提取各组细胞中基因组DNA，应用紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度，采用EZ DNA 甲基化试剂盒对DNA进行亚硫酸钠处理，利用反应柱进行脱硫及净化，纯化后DNA 可用于后续PCR 反应。 PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min、95 ℃变性45 s、58 ℃(甲基化)/57 ℃(非甲基化) 45 s、72 ℃退火45 s，35 次循环，最后72 ℃延伸10 min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析。 FLI-1 启动子甲基化引物序列设计见表2。

表2 FLI-1 启动子甲基化引物设计

1.12 统计分析

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，Graphpad Prism 7.2 绘图。 计量资料采用Kolmogorov-Smirnov法检测数据正态性，符合正态分布的采用“±s”表示，行独立样本t 检验；不符合正态分布的数据用中位数（四分位间距）描述，行Mann-Whitney U 检验。

2 结果

2.1 天马颗粒血清最佳干预浓度

同Blank 组、NC 组相比，TMKL 组含药血清为20%时，HCT116、HT29 和Caco-2 细胞增殖均受到抑制（P<0.05）。因此，选取20%的天马颗粒血清浓度作为后续实验的干预浓度。 详见图1。

图1 不同浓度天马颗粒血清对多种结直肠癌细胞增殖的影响

2.2 天马颗粒血清对FLI-1 蛋白相对表达及mRNA 表达影响

在HCT116 细胞、Caco-2 细胞中，同Blank 组、NC组相比，TMKL 组FLI-1 蛋白及mRNA 表达升高（P<0.05）；同NC 组相比，Blank 组FLI-1 蛋白及mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。 在HT29 细胞中，同Blank 组、NC 相比，TMKL 组FLI-1 蛋白及mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）；同NC 组相比，Blank组FLI-1 蛋白及mRNA 表达差异无统计学意义（P>0.05）。 详见图2。

图2 天马颗粒血清对多种结直肠癌细胞FLI-1 蛋白及mRNA 表达影响

2.3 天马颗粒血清对DNMT1、DNMT3a 蛋白表达影响

在HCT116、HT29 和Caco-2 细胞中，同Blank组、NC 组相比，TMKL 组DNMT1、DNMT3a 的表达量下降（P<0.05）；同NC 组相比，Blank 组DNMT1、DNMT3a 的表达差异无统计学意义（P>0.05）。 详见图3。

图3 天马颗粒血清对多种结直肠癌细胞DNMT1、DNMT3a 蛋白表达影响

2.4 天马颗粒血清对FLI-1 启动子甲基化影响

在HCT116 细胞中，同Blank 组、NC 相比，TMKL组细胞FLI-1 启动子产生了部分去甲基化，甲基化减弱，非甲基化增多；NC 组同Blank 相比无变化。在HT29 细胞中，Blank 组、NC 组和TMKL 组细胞FLI-1启动子无甲基化；在Caco-2 细胞中，同Blank 组、NC 组相比，TMKL 组细胞FLI-1 启动子完全去甲基化，NC 组同Blank 组相比无变化。 详见图4。

图4 天马颗粒血清对多种结直肠癌细胞FLI-1 启动子甲基化影响

3 讨论

DNA 甲基化异常是表观遗传学改变的一个常见形式，并已被证明与多种癌症密切相关[16-17]。 常见的DNA 甲基化包括启动子CpG 岛的局灶性高甲基化和DNA 的整体低甲基化。 前者会触发靶基因的转录沉默，而后者会降低染色体的稳定性，这是癌症发展过程中最关键的表观遗传学改变。DNA 甲基化主要由DNMT 和S-腺苷甲硫氨酸催化。这种变化通常是可逆的。而DNMT1、DNMT3a 是DNMTs 主要组成。DNMT1 主要参与新合成的单链DNA 甲基化，并将甲基化信息传递给后代细胞，在DNA 复制中维持甲基化发挥主要作用。 DNMT3a 主要负责在胚胎发生过程中DNA 甲基化[18]。肿瘤细胞中DNMT 的高表达导致抑癌基因的高甲基化，进而失活，最终导致肿瘤的形成[19-20]。 MSP 是目前较为常用的甲基化检测方法，MSP 条带亮度在一定程度上可代表发生甲基化的基因启动子含量，即反映基因的甲基化水平[21]。

传统中药及一些提取物具有去甲基化作用，相对于化学合成药物，其对正常组织损伤低，副作用小[22]。王剑等[23]研究发现，补肾健骨中药复方通过降低骨组织Leptin 启动子甲基化防治骨质疏松症，任玲[24]运用简化基因组甲基化测序方法发现通脉逐瘀颗粒对冠心病气滞血瘀证的可能机制是降低APOA5基因甲基化水平。陈馨等[25]使用高浓度的姜黄素干预胃癌SGC-7901 细胞后发现，姜黄素对胃癌细胞具有抑制增殖作用，且对p16 和MGMT 基因具有甲基化抑制作用，并促进基因表达。

在天马颗粒血清干预后，HCT116、HT29 和Caco-2 细胞的DNMT1、DNMT3a 表达降低（P<0.05），HCT116 细胞中FLI-1 蛋白及mRNA 表达升高（P<0.05），HT29 细胞中FLI-1 蛋白及mRNA 表达无显著变化（P<0.05），Caco-2 细胞中FLI-1 蛋白及mRNA 表达升高（P<0.05）。

此外，MSP 中Blank 组结果显示，HCT116 细胞中FLI-1 启动子部分甲基化，HT29 细胞中FLI-1 启动子无甲基化，Caco-2 细胞中FLI-1 启动子完全甲基化。MSP 中TMKL 组结果显示，对于存在FLI-1 甲基化的HCT116 细胞和Caco-2 细胞，天马颗粒可以促使FLI-1 去甲基化；而对不存在FLI-1 启动子甲基化的HT29 细胞，天马颗粒对FLI-1 甲基化无影响。

前期研究发现，FLI-1 基因的表达受启动子甲基化调控[15]，DNMT1 及DNMT3a 是维持DNA 甲基化酶，而天马颗粒血清抑制DNMT1 及DNMT3a 表达。 结合上述实验结果推测天马颗粒可能通过抑制DNMT1 及DNMT3a 表达，使得FLI-1 甲基化减弱，从而上调FLI-1 蛋白及mRNA 表达。

综上所述，天马颗粒血清可能是通过抑制DNMT1、DNMT3a 蛋白表达，促使结直肠癌细胞中FLI-1 启动子去甲基化，进而上调其表达。