竹叶柴胡炮制前后有效成分含量分析

刘伟

我国早在南北朝就有《雷公炮炙论》记录柴胡炮制方法,中医也认为对柴胡进行炮制后药效会比作为原材料的生柴胡具有更高药效。目前有使用蜂蜜、白酒、食用醋对生柴胡进行炮制的研究,也有使用鳖血制成鳖血柴胡方法。药材发挥效果机理为其中有效成分在用药条件下是否可以与人体相契合,但是经过炮制后柴胡有效成分是否发生变化存在一定不确定性,需要对其进行完全剖析,从而创造中药临床应用条件。

1 材料与方法

1.1 材料 紫外可见分光光度计选择青岛聚创环保集团有限公司生产的JC-UT2000 型号,电子天平则由上海舍岩仪器有限公司生产的电子分析天平FA 系列,由国华(常州)仪器制造有限公司生产的HDM-250 恒温电热套。采购由西安百川生物科技有限公司生产的柴胡皂苷a,将其作为对照样品使用［1］。竹叶柴胡在淘宝电商平台购买,并将其进行打粉,并过4 号筛将杂质进行筛去后保存备用。在线下超市购买蜂蜜、黄酒与食用醋。色谱醇选择甲醇,使用实验室纯净水,本文涉及到的磷酸、二甲氨基苯甲醛、水饱和正丁醇以及氯化钠溶液都作为分析纯使用。

1.2 方法

1.2.1 炮制柴胡工序

1.2.1.1 醋柴胡 选择生柴胡作为原材料,将其切成适合片状物,并以50 kg 柴胡片与6 kg 醋比例,对柴胡片充分搅拌,拌匀后使其闷润,将食用醋彻底浸透柴胡片,再使用合适大小锅使用文火慢炒,直到柴胡片将食用醋全部吸收干净,表面略有干燥,将其从锅中取出并晒干［2］。

1.2.1.2 酒柴胡 仍是取材、切片工序,以100 kg 柴胡片与10 kg 黄酒比例,依旧搅拌均匀与闷润至透,同样使用文火慢炒方式,取出后需要进行放凉［3］。

1.2.1.3 蜜柴胡 从超市采购的蜂蜜放进锅中,加入开水对其进行溶解,加热熬制,直到其沸腾后,将需要炮制的柴胡片倒入锅中,使用文火对其进行翻炒,直到呈现深黄色,用手接触不粘手,将其取出并放凉［4］。

1.2.2 炮制含量测量 柴胡有效成分主要分为柴胡总皂苷、挥发油以及柴胡多糖等,本文主要研究前两种,其余暂不涉及。

1.2.2.1 柴胡总皂苷含量测量 ①溶液制备：使用电子天平称取柴胡皂苷,加入作为色谱醇的甲醇,将其制成每1 毫升含有0.09 mg 的柴胡皂苷溶液,将其充分摇匀后获得作为空白对照组的对照品溶液；称取经过4 号筛筛选的柴胡粉末2 g,将其放置在带有软木塞的锥形瓶,并加入40 ml 含有2%氢氧化钾的甲醇溶液,采用水浴回流方式,维持1 h,并进行二次提取,将残渣进行过滤后将滤液全部合并在另一个含量为100 ml 的干净量瓶,并使用甲醇将滤液进行稀释,使溶液到达100 ml 刻度线即可［5］。取20 ml 溶液采用水浴法对液体进行彻底蒸干,并使用蒸馏水溶解残留物,再使用已经水饱和的30 ml 正丁醇,取2 次后将正丁醇处理后溶液进行二次水浴法蒸干。将获得残留物使用甲醇充分溶解,转移到50 ml 量瓶中,将其作为用于试验的供试品溶液。②线性关系：将事先制成的对照品柴胡皂苷溶液分别取1～6 ml,共为6 组,放于带有软木塞的试管中,采用70℃水浴方式对溶液水分进行蒸干,利用0.2 ml 1%的二甲氨基苯甲醛将其与固体物质充分混合,溶解固体物质后继续采用水浴方式进行加入蒸干,再次加入8 ml 磷酸,使用水浴方式持续加热30 min后冷却。等到溶液彻底冷却,利用蒸馏水作为空白对照组,将其放置在545 nm 波长位置对其吸光度进行测定,将对照品的含量与其吸光度构建数学方程,可以获得柴胡皂苷的一元线性回归方程,设含量为M,设吸光度为A,其方程可以写作：A=2.2822M-0.0154,r=0.9972,为保持P<0.05 这一条件,对方程计算后可以发现,可以在对照品使用含量0.09～0.54 mg 之间保持较好线性关系。③测量试验：对生柴胡粉末精准称取6 份,对其吸光度进行测定,从而计算生柴胡总皂苷含量［6］。在获得生柴胡数据后取平均数,从而获得柴胡总皂苷拥有1.5197%平均含量,相对偏差值(RSD)为1.16%,即该方法具有较好重复试验效果。任取一类样品溶液,分别于0 h、30 min、1 h 与2 h 时间档次中对吸光度进行测定,其RSD 为1.82%,即配置溶液具有较好稳定性；对已测定含量的柴胡粉末称取0.4 g,将其放置在带有软木塞的锥形瓶内,向瓶中加入4 ml 事先配制含量为1.51 g/L 的对照品,并向其中加入8 ml 含有2%氢氧化钾的甲醇溶液,使用水浴法进行1 h 回流,二次提取后将残渣过滤,再将滤液使用玻璃棒合并入另一只干净锥形瓶中,再次使用水浴方式对溶液蒸干,使用蒸馏水将残留物充分溶解,加入30 ml水饱和正丁醇,充分萃取,重复两次,将正丁醇溶液进行合并,使用水浴方式将溶液充分蒸干,使用甲醇溶液将残留物充分溶解后使用玻璃棒将其转移至50 ml 量瓶中,对其有效成分含量进行测定,并对加入样本的回收率采用科学方式进行计算,在6 组试验组中,柴胡皂苷平均回收率可达100.57%,而RSD 则为1.75%。超过100%回收率,其原因是柴胡样品中含有部分柴胡皂苷a,并在后续量入两次柴胡皂苷a,在蒸发多余溶液后可以获得较高回收率；使用滴管吸取供试品溶液2 ml,放置在带有软木塞试管内,采用水浴方式对溶液进行蒸干,检测其残留物的吸光度,计算竹叶柴胡的皂苷含量,可以发现作为对照组的生柴胡总皂苷为1.5197%,而使用黄酒、食用醋与蜂蜜炮制柴胡的皂苷含量分别为1.1275%、1.3175%与2.0376%。

1.2.2.2 挥发油含量测量 研究柴胡挥发油称取10 g已过4 号筛筛选的柴胡粉末,将其放置在250 ml 容量的圆底烧瓶内,并向其中注入100 ml 15%氯化钠溶液,使用加热方式,保持其有1 h 的回流,回流装置为2010 年出版的《中国药典》改造的可以对挥发油测量的设备。在提取溶液6 h 后以25 ml 量瓶为容器,收集全部蒸馏液,并将蒸馏水注入容器中定容,充分摇匀后量取2 ml 馏出液,再加入蒸馏水进行稀释,使其达到10 ml。另外量取2 ml 馏出液,放置于蒸发皿内,使用水浴方法将溶液蒸干,获得残渣再次注入蒸馏水制成10 ml 溶液,充分摇匀,将其作为试验空白对照组［7］。利用紫外分光度法,保持277 nm 恒定波长,测定溶液吸光度。获得经过炮制处理后柴胡的挥发油含量均超过生柴胡,而且蜜柴胡仍在试验组中拥有最大挥发油含量。

2 结果

以竹叶柴胡为试验材料,使用3 种炮制方法作为试验组,生柴胡作为对照组,可以发现其有效成分柴胡皂苷a 与挥发油在炮制处理前后含量均发生相应变化,炮制后挥发油含量均超过生柴胡,而蜜柴胡含量最高,其次为酒柴胡、醋柴胡；蜜柴胡的柴胡皂苷a 含量达到2.0376%,高于生柴胡的1.5197%,而酒柴胡的柴胡皂苷a 含量为1.1275%,醋柴胡的柴胡皂苷a 含量为1.3175%,均低于生柴胡。对于柴胡成分做实验室分析后,可以发现生柴胡使用食用醋与黄酒炮制前后出现功效差异,分析原因是竹叶柴胡内化学成分发生变化,而化学成分发生变化导致柴胡药理作用也发生变化,这个研究方向也与中药理论的炮制改变药物性质目的保持一致,另一个角度对于中药综合整体思考与辨证讨论进行验证,体现其科学性［8］。同时,本文研究皂苷与挥发油的思路清晰明确,可以将其作为模板,套用在其他成分含量研究中也适用。还可以借助柴胡研究方法对其他中药材同样测定有效成分,在经过加工处理后是否出现含量变化进行研究。

3 讨论

本研究试验的蜜柴胡皂苷与挥发油的含量要明显高于生柴胡,而黄酒与食用醋炮制后皂苷含量方面要低于生柴胡,经过炮制挥发油含量均有所上升［9］。本文提出一个设想,在柴胡进行炮制时,会因组织吸收大量热能,造成部分组织破坏,从而让挥发油更容易溶出,分析纯则加快溶出速度,所以无论是使用黄酒、食用醋或者蜂蜜进行柴胡炮制,其挥发油含量均要高于生柴胡。挥发油会在文火炒制时溶出,但也会造成皂苷等在酸性环境下产生相应影响,更容易使其环氧醚键出现开环情况,进而转变为其他成分,极有可能是黄酒与食用醋炮制柴胡皂苷含量下降原因［10-12］。同时,因为篇幅有限,所以对于炮制有效成分变化原因仅限于炮制方法,并未进一步深入研究,例如柴胡的品种差异、炮制辅料量、温度等都需要在未来研究中进一步讨论。

综上所述,中药成分相对复杂,使用常规手段难以彻底理清其真正作用机理。本文以竹叶柴胡为材料,对其进行炮制前后是否存在有效成分的含量变化进行探索,在一定程度上也是忽略采用不同方法进行炮制获得制品的额外影响。虽然从数据上可以分析出蜜柴胡比柴胡炮制效果更佳,但是在实际应用时也要以临床实践为标准,降低中药材在机理方面相克的负面影响。