乳及乳制品中蛋白质含量测定方法研究进展

刘利娟

（鹤壁职业技术学院食品工程学院，河南鹤壁 458030）

乳制品日渐成为成人和儿童的主要蛋白质来源，而牛乳的组成比较复杂，其中含有3%～4%的蛋白质，蛋白质能在机体内氧化产生能量，是人体必需的能源物质。乳蛋白中有较高的必需氨基酸利用率，是因为乳蛋白中含有多种人体所必需的氨基酸，且分子量较小，较易吸收[1]，所以牛乳中的蛋白是人类比较理想的优质蛋白。对于不同的样品，怎样选择合适的前处理方法，怎样达到最优的检测结果，已日益成为科学研究者们最关注的焦点。本文综述了乳及乳制品中蛋白质的检测方法，尤其是方法的原理、优缺点以及研究的现状等，以便于选择合适的乳及乳制品中蛋白质检测的方法。

1 凯氏定氮法

凯氏定氮法是1883 年凯氏发明的一种用于氮的测定的方法，这已成为分析化学中一个经典的测量方法并且被广泛使用。这种方法分两个阶段，最开始是经典的凯氏定氮法，但是传统的方法采用混合指示剂对颜色变化进行判断滴定终点，误差较大。为确保滴定结果的准确性，多采用电位滴定法或酸度计结合的方法完成测定。但是氨在蒸馏时容易发生倒吸，碱的加入量不好控制，故研制了自动定氮仪，它可以快速测定蛋白质的含量，也可有效防止消化、蒸馏过程中的人为误差，在提高效率的同时提高了检测的准确性。

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，用酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量[1]。

近年来国内外学者对凯氏定氮法和其他方法的比较研究甚多。如霍丽娜进行了杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定奶粉和粮食中氮及蛋白质含量的研究分析，结果表明凯氏定氮法同杜马斯燃烧法相比较，相对标准偏差更大，稳定性较差，但杜马斯燃烧法的测定结果略高于凯氏定氮法，因凯氏定氮法测定蛋白质含量是通过凯氏因子换算出来的，结果不包含所有的氮，所以测得的蛋白质的含量较杜马斯燃烧法偏低[2]。卢锦斌、张利敏[3]等人对改良凯氏定氮法进行了研究，国内外主要围绕消煮、蒸馏及滴定三个环节进行改良，其中消煮环节中，Bowman等[4]采用双氧水测定法，大大地提高了测定的准确性。易中华、肖世平等人进行了水杨酸钠比色法与凯氏定氮法测定粗蛋白质含量的比较研究，结果表明比色法比较简单易行，比较适合基层实验室推广，但是比色法对环境污染比较大[5]。朱文秀等人进行了自动定氮仪法与国标凯氏定氮法测定油菜籽蛋白质含量的比较研究，结果发现自动定氮仪较国标大大缩短了工作时间，提高了工作效率，且此方法更易推广[6]。

该方法的优点是通用性强，测定费用低，易实现，仪器简单且测定结果的重复性和重现性都很好，但也存在时间长、灵敏度低等缺点。凯氏定氮法测的是总蛋白的量，一些非蛋白氮无法检测出，一些商贩利用掺入非蛋白氮的方法牟取利益，例如三聚氰胺事件。对此2010 年6 月1 日新的国家标准开始实施，即GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》，此标准代替了GB/T 5009.5-2003，更加完善了蛋白质检测准确性的内容。

2 分光光度法

2.1 双缩脲法

近几年国内对双缩脲法的研究与国外相比较多，如周艳星[7]对乳制品饮料中蛋白质含量测定方法的比较分析，双缩脲的方法可以快速测定蛋白质，检测结果准确，但是灵敏度不高。李宏梁等人的双缩脲法和凯氏定氮法测定牛乳中酪蛋白质量分数的比较研究。

该方法适合检测总蛋白质的含量，它具有操作简单、测量速度快等优点，但是标准物质必须使用代表性很强的样品，由于要使用其他参考方法测出标准物质中的蛋白质总含量，这种测定工作较为费力费时。所以双缩脲法不宜用来测定样品种类多、彼此差异大的样品的总蛋白含量。

2.2 考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝法是由Bradford于1976年建立的，它有G-250和R-250 两种，其原理是在酸性条件下，G-250 染料与碱性氨基酸以及芳香族氨基酸残基结合，G-250 染料的最大吸收峰由465 nm 增加到595 nm，溶液颜色从棕黑色变为蓝色，样品中蛋白质的浓度与该染料的吸光度（595 nm）成正比关系[6]，从而测定蛋白质的含量。

周艳星[7]等人进行了考马斯亮蓝法与双缩脲法检验乳制品中蛋白质含量的分析比较，结果显示考马斯亮蓝法操作更加简单，更加快速准确。冯昕等人进行了考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量的研究，在牛血清白蛋白溶液中加入氨基酸及酚类物质，该法精密度高、稳定性和重现性好，抗干扰能力强。南亚等人进行了考马斯亮蓝G-250 法快速测定牛乳中的蛋白质的研究。

该方法具有高精度、高效率、检测过程简便、抗干扰能力强、所需试剂少等优点，但此方法由于测定误差大，不适用于不同蛋白的检测，可应用于医疗保健及食品行业的蛋白质测定。

2.3 Folin－酚试剂法

Lowry 法是双缩脲法的发展，它结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是最灵敏的蛋白质测定方法之一，在生物化学领域得到广泛的应用。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，该复合物在色氨酸残基、芳香族氨基酸残基、酪氨酸的作用下，使磷钼酸盐-磷钨酸盐还原，在750 nm 波长处有最大吸收。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白质含量呈正相关。

国内外近几年采用福林酚法的文献比较少，这种方法大部分被用来测低浓度的蛋白质定量检测，如高英等人用福林酚法测定脑蛋白水解物溶液中多肽的含量；黄满红等人对生活污水中蛋白质测试方法进行了研究，由于生活污水中有腐殖质物质，研究还对该方法做出了改进，设置了2 个平行，从而提高了准确率。

该测定法的优点是灵敏度高，缺点是耗费时间长，操作时间要精准的控制，标准曲线绘制麻烦，并且专一性较差，干扰物质比较多。

2.4 茚三酮法

国内外对茚三酮的研究相对较少，文献中对茚三酮的研究主要是对蛋白质水解度检测。这种方法是比较古老的方法，国内最新的研究是罗艳华等人进行蛋白水解物水解度测定研究，分别对OPA 法、TNBS 法、茚三酮比色法进行比较，发现茚三酮方法因吸光度波动大，方法的重现性差。另外还有杨文博等人对蛋白质水解度测定方法的研究；檀志芬等对蛋白质水解度的研究，这种方法非常灵敏，但是显色剂稳定性较差。

2.5 BCA 法

铜离子在蛋白质的作用下还原成亚铜离子，在碱性条件下亚铜离子与BCA 结合生成紫红色络合物，在562 nm 处具有最大吸收峰。在一定条件下，复合物的吸光度值与蛋白质的浓度成正比例关系。BCA 是一种极敏感的蛋白呈色剂，BCA 法的测定范围较宽，测定蛋白质简单、灵敏且快捷。这种方法在医学上的研究也很广泛，如王丽等人利用BCA 法对百日咳疫苗中间品蛋白含量进行了有效性检验分析，此方法能够实现高通量、快速、准确的检验；曹玉华等人测神奇灵药颗粒中的蛋白含量；周志军等人用此法检测人凝血因子中蛋白质的含量，该方法步骤简单，比经典的Lowry 法快4 倍，且操作更加方便，检测下限能够降至25 μg/mL，最低检测量为0.5 μg。

3 电泳法

3.1 SDS-PAGE 凝胶电泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳能够较好地对蛋白质进行定性、定量分析，它根据浓缩胶和分离胶是否相连分为连续系统和不连续系统。由于在不连续系统中蛋白在进入分离胶之前可以等速浓缩，所以通常使用的是不连续系统。在以前的研究中用这种方法测的小肽等小分子比较多，而近几年的研究中多用此方法来测定β-乳球蛋白和乳清蛋白的含量等，如韩奕奕等人用凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定对β-乳球蛋白的测定；金江玉等人将此方法广泛应用于液态乳中水解蛋白的掺假实验等。

为了提高检测的灵敏性，秦慧等人又对电泳做出了改进，进行了双向电研究，改良了考马斯亮蓝染色法和银染法，改良后蛋白质灵敏性高，质谱兼容性好。

3.2 高效毛细管电泳法

毛细管电泳（CE）作为一种最新的色谱分离技术，主要有毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等速电泳（CIE）、毛细管等电聚焦（CIF）、毛细管凝胶电泳（CGE）及无胶筛分毛细管电泳（NGSCE）等多种模式。毛细管电泳具有选择性和解析能力强、灵敏度高、样品和溶剂消耗少、易于量化等优点，广泛应用于蛋白质的分析领域。

近几年来对此法的研究多集中在医学、生命科学等领域，主要用于对蛋白质、多肽、核酸等大分子的研究，如赵新颖等人在乳品蛋白检测中有所应用；李晓斌用于化妆品及食品分析研究；张慧洁等人使用毛细管电泳仪测定胶原蛋白的分子质量分布；王有等人用毛细管电泳法代替凝胶电泳对蛋白质和肽进行分离检测。

毛细管电泳具有分离度极高、分离速率高、消耗样品量少等优点，但是因注射量小、波长有限等原因导致检测浓度非常受限。

4 色谱法

4.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）具有简单、准确、重现性好等优势，所以近年来越来越多的企业更倾向使用此法对蛋白进行检测。它同气相质谱而言，能够分离高沸点、受热不稳定的的混合物，所以应用范围更加广泛。其缺点在于对分子结构特性相似的蛋白难以达到完全分离，流动相试剂大多为有机试剂，对人体和环境都会造成不同程度的危害，且检测成本较高。

近几年使用该法对牛奶中的掺伪检验的研究比较多。如魏秀莲等人用液相色谱法快速检测牛奶中三聚氰胺的方法研究；黄艳红等人用此方法测定乳品中的三聚氰胺。同时，该方法还可应用于饲料、医学等方面的研究，例如魏姜勉建立了高效饲料氨基酸检测方法，方法适用于大豆、豆粕、鱼粉和混合饲料的检验中；张连龙采用高效液相色谱双柱法测定了低聚异麦芽糖含量。

4.2 HPLC 联用技术

高效液相色谱联用的技术应用广泛，主要有高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）、高效液相色谱-电感耦合等离子体原子发射光谱（HPLC-ICP-AES）、高效液相色谱-毛细管电泳（HPLC-CE）、高效液相色谱-等速电泳（HPLC-ITP）等。高效液相色谱-质谱联用技术能够有效分离和鉴定难挥发、高沸点和热不稳定化合物，广泛地应用于食品、环保、生化、医药等领域。

国内外对此法均有研究，如甘宾宾等人将该技术运用在食品安全中；蔡勤仁等人用此法对饲料中的三聚氰胺进行测定；国外的Monfort Anaëlle 等人采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/ MS）同时定量母乳中19 种分析物。

5 结束语

随着科学技术的不断发展，检测乳及乳制品中蛋白质的方法也在不断地改进，方法之间的检出限、检测精度、适用范围不同，不同的方法均有自身的优缺点。虽然新建立的许多方法操作简单、检测快速、灵敏度和重现性良好，但存在检测费用高、不能够大批量检测等缺点。因此，对于乳及乳制品的检验，建立可操作性强、适用范围广、检测成本低的最快速、最微量的检验方法将是未来研究的重点方向。