一种水溶性超分子荧光探针对农药缩节胺的识别

陈丽霞，宋桂先，杨 梅，黄 英,3，卫 钢，陶 朱*

(1.贵州大学 贵州省大环化学及超分子化学重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学 神奇民族医药学院，贵州 贵阳550005；3.贵州大学 西南药用生物资源教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025；4.澳大利亚联邦科学与工业组织(CSIRO)，新南威尔士州 2070)

缩节胺(mepiquat chloride, MC)，化学名N,N-二甲基哌啶嗡氯化物，是一种白色或浅黄色的粉状物质，水溶液中无荧光发射。因其对植物生长调节具有高效、低毒、广谱的特性，在农产品方面广泛应用[1]；然而缩节胺作为植物生长调节剂对人类和动物的不良影响已得到广泛报道和研究[2]，因此，建立一种简单、快速检测MC的方法是必然的。近年来，对缩节胺残留的检测已有毛细管电泳-质谱法[3]和液相色谱-质谱法[4-6]等，但是这些方法都需要用到质谱仪，所需仪器昂贵，分析成本高[7-8]。

超分子荧光探针是由具有空腔结构的主体分子作为外来物质的接受体，主体分子和荧光分子通过非共价作用形成的一类荧光传感器[9-12]。超分子荧光探针可用于阳离子、阴离子、生物分子(蛋白质、DNA和氨基酸)以及药物分子等物质的检测，其检测机理主要是客体分子的竞争或协同作用，光诱导电子转移、能量转移、电子转移等。这种简单、快速、灵敏的识别方式近年来受到研究者广泛的关注[13-20]。

瓜环又称葫芦脲(cucurbit[n]urils, 简称Q[n]或CB[n])，是一个高度对称的、刚性的、南瓜形状的大环笼状化合物，由亚甲基桥联的“n”个苷脲单元组成，具有一个电中性疏水空腔、两个负电性羰基修饰端口以及正电性外壁三大特征[21]。由于瓜环空腔内外的极性等存在差别，荧光物质在瓜环空腔内或外面时，其理化性质、光学性质会发生不同程度的变化。因此，可通过瓜环与具有荧光的客体分子构成超分子荧光探针，待检测分子与超分子荧光探针作用后导致荧光探针发光性质改变，再通过测荧光探针发光特性的变化来实现目标分子的测定[9-10]。对于空腔较大的Q[8]来说，通常能与尺寸合适的客体分子形成稳定的三元超分子配合物。

本文通过碱性黄T (thioflavin T, ThT)与Q[8]间的非共价键主客体相互作用，形成了一种水溶性Q[8]/ThT配合物，且该配合物在570 nm处产生强烈的新型准分子发射带[22]，从而设计了一种用于无荧光性质的MC的选择性识别的超分子荧光探针体系。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：Q[8]按文献[23]由本实验室自制，ThT、MC均购自Sigma-Aldrich试剂公司；实验用水为去离子水。仪器：紫外-可见分光光度计(Agilent 8453，美国安捷伦)；荧光光谱仪(Cary Eclipse，美国瓦里安)；等温滴定量热仪(Nano ITC，美国TA仪器)；400 MHz核磁共振波谱仪(JNM-ECZ400S，日本电子株式会社)。

1.2 实验部分

1.2.1光谱的测定

将Q[8]配制成0.1 mmol/L溶液，ThT配制成1.0 mmol/L溶液，MC配制成1.0 mmol/L的母液备用。实验所提的各个溶液的浓度均通过稀释法获得。

采用摩尔比法进行光谱测定：向若干个10 mL的容量瓶中依次加入0.2 mL浓度为1.0 mmol/L的ThT溶液，再向其中分别加入0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0、5.0 mL浓度0.1 mmol/L的Q[8]溶液，用pH=7的Tris-HCl溶液定容。摇匀放置10 min，在250～600 nm波长范围内测量各个溶液的紫外-可见吸收光谱。样品池是光程1 cm的标准石英比色皿。在激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，激发波长为309 nm条件下，测定体系的荧光发射光谱。

固定探针Q[8]/ThT的浓度为20.0 μmol/L，改变MC的加入体积，并用Tris-HCl溶液调节体系pH=7，定容，使体系中MC的浓度范围为0～20.0 μmol/L。摇匀放置10 min，在激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，激发波长为309 nm条件下，测定体系的荧光发射光谱。

1.2.2氢核磁共振谱的测定

在25 ℃条件下，以氘代水为溶剂，使用日本JEOL JNM-ECZ400S型400 MHz核磁共振波谱仪测定Q[8]与ThT及MC作用的1H NMR谱图。

1.2.3等温量热滴定法的测定

ThT和MC分别配制成浓度为1.0 mmol/L母液备用，Q[8]配制成浓度为0.1 mmol/L母液。以水为参比溶液，采用Nano ITC等温滴定量热仪测定主体分子Q[8]分别与客体分子ThT、MC在25 ℃下的平衡常数及热力学参数，样品池体积为1.3 mL，搅拌速度为250 r/min，6 μL/滴，间隔时间为250 s。

2 结果与讨论

2.1 MC对Q[8]/ThT荧光探针的荧光猝灭

ThT是一种常见的荧光标记染料，常用于淀粉样原纤维的荧光标记[24-25]。ThT溶液中加入Q[8]溶液后，溶液荧光逐渐增强，通过非共价键与Q[8]形成了2 ∶2的超分子配合物，与文献[22]一致。

当在Q[8]/ThT(2 ∶2)水溶液中逐渐滴加MC，随着MC浓度的增加，体系在414 nm处的最大紫外-可见吸收光谱逐渐降低，且在440 nm处出现一个增强的峰，当MC的浓度达到20.0 μmol/L时，紫外可见吸收光谱无明显变化(图1(a))。从图1(b)可以看出：体系的荧光强度随MC的浓度的增加逐渐降低，同时伴随着最大荧光发射峰从570 nm逐渐移至490 nm，蓝移了大约80 nm，且MC在该激发波长下无荧光发射。因此，可利用Q[8]与ThT形成主客体超分子配合物Q[8]/ThT的荧光“开-关”效应，实现对MC的检测。

(a)紫外-可见吸收光谱 (b)荧光光谱 (λex=309 nm)图1 在pH为7的Tris-HCl溶液中，荧光探针Q[8]/ThT(20.0 μmol/L)随不同浓度MC(0～20.0 μmol/L)作用光谱Fig.1 Absorption and fluorescence spectra of Q[8]/ThT(20.0 μmol/L) in pH=7 Tris-HCl solution at different concentrations of MC (0～20.0 μmol/L)

2.2 pH值及共存离子对Q[8]/ThT探针的影响

为了考察pH值对探针Q[8]/ThT荧光强度的影响，测定了不同pH值下探针Q[8]/ThT的荧光强度。图2是探针Q[8]/ThT在pH为2～11范围内的570 nm处荧光发射强度的变化。从图2可以看出：探针Q[8]/ThT在pH为5～9时，荧光强度最强且变化辐度不大，因此选择pH=7的Tris-HCl溶液作为测试介质。

图2 在不同pH值的Tris-HCl溶液中，Q[8]/ThT在570 nm处荧光强度变化(λex=309 nm)Fig.2 Variation of fluorescence intensity of Q[8]/ThT at 570 nm under different pH in Tris-HCl solution (λex=309 nm)

表1 离子干扰结果Tab.1 The result of ion interference study

2.3 探针Q[8]/ThT识别MC的检出限

MC能使Q[8]/ThT探针的荧光强度减弱。在pH=7的Tris-HCl溶液中考察Q[8]/ThT (20.0 μmol/L)荧光强度下降值随MC浓度的变化。根据其工作曲线(图3)可得，当MC的浓度在2×10-8～30×10-8mol/L范围时，MC的浓度与Q[8]/ThT荧光探针强度的降低值呈线性关系，线性方程式：△F=8.31C+44.41，R=0.989。依照IUPAC规定，根据CL=KS0/S计算求得探针检测MC的检出限为3.6×10-8mol/L。式中：K为与置信水平相关的常数，当置信水平为90%时K取3；S0为测定10次空白溶液的标准偏差；S为校正曲线的斜率。

图3 在pH=7的Tris-HCl溶液中，Q[8]/ThT (20.0 μmol/L)荧光强度下降值随MC浓度变化曲线Fig.3 Fluorescence intensity decreasing values of Q[8]/ThT (20.0 μmol/L) changing with the MC concentrations in Tris-HCl (pH 7)

2.4 Q[8]/ThT超分子荧光探针对MC识别机理

为了探讨Q[8]/ThT超分子荧光探针对MC的识别原理，利用1H NMR和ITC考察了超分子荧光探针Q[8]/ThT与MC相互作用情况。Q[8]/ThT与MC相互作用的1H NMR谱图如图4所示。由图4(a)和(b)可以看出：与游离的客体相比，作用的ThT的质子H1向高场方向移动了0.03，H2向低场方向移动了0.80，H3—H8向高场方向分别移动了0.82、0.60、0.70、0.97、0.58、0.83，表明ThT大部分受到了瓜环的屏蔽作用，即ThT大部分进入Q[8]空腔[12]。同样，由图4(d)和(e)可以看出：作用MC与游离MC比较，Ha—Hd向高场分别移动了0.20、0.21、0.21、0.20，说明MC进入到Q[8]的空腔，发生了主客体相互作用。随着MC滴入Q[8]/ThT中(图4(e))，ThT的所有质子相对于Q[8]/ThT中的质子几乎没有变化，而MC的所有质子和游离MC相比均在低场，即非游离的MC，亦非单独与Q[8]、与MC作用的MC的质子，可能是MC与Q[8]/ThT荧光探针中的Q[8]的端口进行主客体相互作用。因此，我们推测出Q[8] ∶ThT ∶MC为2 ∶2 ∶2的作用模式。荧光探针(Q[8]/ThT)对MC的“开-关”识别示意如图5所示。

(a) ThT；(b) Q[8]/ThT (2 ∶2)；(c) Q[8]/ThT/MC (2 ∶2 ∶2)；(d) Q[8]/MC (1 ∶2)；(e) MC。图4 Q[8]与ThT及MC作用的1H NMR谱图Fig.4 1H NMR spectra for the cucurbit[8]uril with ThT and MC

图5 荧光探针(Q[8]/ThT)对MC的“开-关”识别示意图Fig.5 Schematic representation of the “on-off” recognition of MC for Q[8]/ThT fluorescent probe

进一步使用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)研究了Q[8]/ThT超分子荧光探针对MC的识别机制。在25 ℃下，Q[8]分别与ThT和MC相互作用，其热力学拟合参数见表2，等温滴定量热图如图6所示。Q[8]与ThT的结合常数Ka1=(8.33±0.28)×107L/mol，Ka2=(9.12±0.12)×105L/mol，Q[8]与MC的结合常数Ka=(7.70±0.41)×106L/mol。结果表明，ThT和MC都能够分别与Q[8]发生主客体作用，形成主客体复合物。然而，由于Q[8]与ThT的作用强于MC，因此，推测当ThT与Q[8]形成Q[8]/ThT超分子荧光探针后，MC不能够进入Q[8]的空腔，只能与Q[8]的端口作用。该结果与1H NMR测试结果相符。

表2 Q[8]与ThT和MC相互作用的热力学参数Tab.2 Thermodynamic parameters obtained by ITC for the Q[8] complexation of ThT and MC in aqueous media

(a)ThT (b)MC图6 在25 ℃下，Q[8]分别与ThT和MC相互作用的等温滴定量热图Fig.6 ITC profiles for the cucurbit[8]uril with ThT and MC at 25 ℃

3 结论

本文基于超分子识别作用原理构筑了一种Q[8]/ThT超分子荧光探针，研究在Tris-HCl溶液(pH=7)中荧光探针Q[8]/ThT对MC的识别响应。结果表明：荧光探针Q[8]/ThT对MC具有良好的识别能力，分析测试结果表明该方法具有检出限低，快速的优点。此外，利用氢核磁共振波谱及等温滴定量热法考察了Q[8]/ThT超分子荧光探针对MC识别机理，即ThT与Q[8]通过非共价主客体相互作用，形成了2 ∶2的主客体包结超分子荧光探针(Q[8]/ThT)，而MC的加入使其能够进一步与该超分子荧光探针中Q[8]的端口发生主客体相互作用，从而使Q[8]、ThT和MC形成了2 ∶2 ∶2作用模式的超分子三元检测体系。