MGMT和p-ERK表达在恶性黑色素瘤中的临床病理价值

李 强 曾 姝 陈建祥 王 侠 张伟明 胡庆龙 邓美仪 梁容瑞

恶性黑色素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤，常见的皮肤恶性黑色素瘤可分为4型，即浅表扩散型、结节型、肢端雀斑样型、恶性雀斑样型，我国以肢端雀斑样型最常见[1]。皮肤恶性黑色素瘤发病率虽低，但恶性程度居所有皮肤肿瘤之首[2]，转移发生早，死亡率高，晚期恶性黑色素瘤患者的5年生存率不足20%[3]，因此，早发现、早诊断、早治疗成为延长恶性黑色素瘤患者生存期的关键。皮肤恶性黑色素瘤诊断的金标准为病理检查，目前临床上行病理检查时已经结合免疫组化染色观察，通过检测黑色素瘤特异的分子标志物如S-100、HMB-45 等的表达情况帮助恶性黑色素瘤的诊断。此外，相关基因表达水平的检测也是诊断黑色素瘤发生的重要手段[4]。本实验通过对32例原发性黑色素瘤和16例转移性黑色素瘤组织芯片的免疫检测分析，探讨p-ERK和MGMT在恶性黑色素瘤组织中的表达水平及临床病理价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 恶性黑色素瘤组织芯片 石蜡包埋的恶性黑色素瘤组织微阵列芯片，由西安艾丽娜生物科技有限公司提供。含TNM和临床分期，48例/48点，含32例原发性黑色素瘤，16例转移性黑色素瘤，一例一点。

1.1.2 试剂 一抗Rabbit anti-human MGMT、Rabbit anti-p-ERK1/2来自美国CST公司，二抗HRP Goat anti-Rabbit IgG(H+L)来自美国immunoway公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 (1)恶性黑色素瘤组织芯片蜡块切片脱蜡和水化；(2)消除内源性过氧化物酶的活性；(3)抗原修复：水浴锅加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95 ℃左右，放入组织芯片加热10～15 min,缓冲液自然冷却后将玻片置于PBS(pH=7.4)中在摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；(4)封闭：在组化圈内滴加5%正常山羊血清均匀覆盖切片，室温封30 min，甩去多余液体；(5)滴加一抗：在切片上滴加配好的一抗，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜后玻片置于PBS(pH=7.4)中在摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；(6)加二抗：甩去多余液体后滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50 min；(7)DAB显色：玻片置于PBS(pH=7.4)中在摇床上洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加DAB显色液，显微镜下控制显色时间，3～5分钟，棕黄色为阳性，蒸馏水充分冲洗切片终止显色；(8)复染细胞核：苏木精复染45 s左右，蒸馏水洗，苏木精分化液分化几秒，蒸馏水冲洗，苏木精返蓝液返蓝，蒸馏水冲洗；(9)脱水封片：将切片依次浸泡；(10)透明：将切片放入100%二甲苯 10 min脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；(11)显微镜镜检并拍照。

1.2.2 免疫组化结果判定 由2位经验丰富的病理医师进行双盲阅片。阳性表达为细胞膜和(或)胞浆上呈现棕黄色颗粒；采用半定量的结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。(1)阳性着色细胞：每张切片上观察5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数<5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分， >75%为4分。(2)阳性着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(3)两者计分相乘即为阳性等级：0分为阴性(-)，1～4为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.3 观察指标

根据恶性黑色素瘤组织芯片中p-ERK和MGMT免疫组化检测的评分结果(-、+、++、+++)将恶性黑色素瘤患者分为p-ERK和MGMT阳性组、p-ERK阳性和MGMT阴性组、p-ERK阴性和MGMT阳性组、p-ERK和MGMT阴性组4组，分析恶性黑色素瘤组织中p-ERK和MGMT的表达与恶性黑色素瘤患者临床病理因素(年龄、性别、病理类型、病理分级分期)的关系。

1.4 统计学方法

所有数据用SPSS 13.0统计软件进行卡方检验，定P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p-ERK和MGMT在恶性黑色素瘤组织中的表达水平

根据MGMT和p-ERK免疫组化检测结果发现，48例恶性黑色素瘤组织中，p-ERK和MGMT均阳性的有19例、p-ERK阳性和MGMT阴性的有11例、p-ERK阴性和MGMT阳性有1例、p-ERK和MGMT均阴性的有17例。结果显示，恶性黑色素瘤组织中p-ERK和MGMT的表达水平呈正相关，结果见表1。

表1 MM组织中MGMT和p-ERK1/2免疫组化检测结果/例

2.2 恶性黑色素瘤组织中p-ERK、MGMT表达水平与其临床病理特征的相关性

MM组织中p-ERK、MGMT表达水平与患者年龄、性别、TNM分期、标本来源等均无明显相关性(P>0.05)，见表2。

3 讨论

黑色素瘤发展和进展相关的最常见的基因突变是BRAF突变[5]。超过50%的黑色素瘤存在激活BRAF激酶突变[6]，其结果是RAF丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号的结构性激活，以促进黑色素瘤增殖和抗凋亡[7]。p-ERK是磷酸化激活的ERK，活化后由胞质转位到核内，进而介导EIK-1,ATF,Ap-1，c-fos和c-Jun的转录活化，参与细胞增殖分化、形态维持、骨架构建、细胞凋亡和细胞癌变等多种生物学反应。有研究证明了p-ERK是PTEN受损的黑色素瘤中与BRAF抑制剂抵抗相关的一种重要介质[8]。许多研究报道，p-ERK还介导肿瘤进展和耐药性[9]。例如，p-ERK的激活通过诱导细胞上皮向间充质转化(EMT)[10]促进肿瘤转移。

表2 MM患者MGMT、p-ERK1/2检出情况与其临床病理因素的相关性分析

06-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)是一种损伤逆转自杀酶，在与烷化剂相关的化疗耐药性中起着重要作用[11]。相关的研究支持MGMT是转移性黑色素瘤患者对烷化剂治疗的临床反应的预测因子[12]。Stefano等的数据表明，MGMT启动子甲基化可能是决定哪些黑色素瘤患者应接受TMZ化疗的一个重要因素[13]，但是其在恶性黑色素瘤中的预后价值尚未明确。TMZ属烷化剂类化疗药物，是晚期黑色素瘤化疗中的常用药物。TMZ对肿瘤细胞的杀伤作用主要是使DNA链的甲基化，不但阻断DNA复制，还可进一步引起DNA单链或双链断裂，导致肿瘤细胞周期阻滞，进而引起肿瘤细胞分裂增殖停止或死亡。而MGMT可修复细胞中DNA烷基化损伤，抑制烷化剂引起的细胞毒性作用，这可能是黑色素瘤细胞对TMZ产生耐药的原因。

当前研究表明恶性黑色素瘤组织中p-ERK和MGMT的表达水平呈正相关。之前的研究表明，ERK阻断剂U0126通过阻断MAPK/ERK途径下调MGMT mRNA和MGMT蛋白的表达[14]，这提示ERK和其活化形式p-ERK可能与MGMT的表达水平成正相关关系，但具体的机制还有待进一步研究。我们的研究结果说明MGMT表达与恶性黑色素瘤患者的年龄、病理分期、标本来源无关(P>0.05),原因可能是我们所采用的标本量较少，为了进一步验证MGMT和p-ERK表达与恶性黑色素瘤临床病理的相关性，需进一步采集更多的标本研究。

综上所述，我们通过免疫组织化学方法检测恶性黑色素瘤组织芯片中MGMT和p-ERK蛋白的表达水平，结果表明MGMT与p-ERK的蛋白表达水平呈正相关。这提示，ERK通路抑制剂与TMZ联用有望增加TMZ对恶性黑色素瘤细胞的杀伤作用，逆转恶性黑色素瘤对TMZ的耐药，增强临床治疗效果，但仍需进一步实验研究予以证实。