非洲猪瘟病毒荧光PCR检测的污染控制

王 婷

（新疆昌吉州动物疾病预防控制中 831100）

自从非洲猪瘟传入我国以来，它对我国生猪养殖产业带来了较大的威胁，有时，还会因非洲猪瘟病毒的传播与蔓延，造成生猪流行性传染疾病，给生猪养殖企业或农户带来巨大经济损失。近年来，预防和治疗非洲猪瘟病毒传播与蔓延，已成我国生猪产业防治的重点，并探索和研究比较有效的预防方法和治疗措施，用以保护我国生猪养殖产业不受其害，壮大我国生猪养殖产业，促进新时代社会经济建设与发展。为此，我国有关主管部门已经适时发布了针对非洲猪瘟病毒的检测方法，要求各地应用荧光PCR方法，强化对非洲猪瘟病毒的检测，并为我国生猪养殖产业起到了比较好的预防和控制作用。通过检测实践证明，应用非洲猪瘟病毒荧光PCR检测方法，其检测结果相对有效。但是，需要控制在检测过程中出现的环境污染问题，否则，不但会影响检测结果的准确性，还会因检测结果出现的漏洞，不能及时采取应对预防措施，造成非洲猪瘟病毒的传播与蔓延，给我国生猪养殖产业带来难以估量的经济损失。

1 应用非洲猪瘟病毒荧光PCR检测方法需要的设施环境

众所周知，我国地域广大，幅员辽阔，各地造就的自然环境和生猪生长环境不同，形成的非洲猪瘟病毒检测环境同样不同。比如，地处我国西北边陲的新疆昌吉地区，因其地处地球北纬纬度比较高的地带，形成的气候条件，是夏短冬长，气温温差极大。如果在这一地区进行非洲猪瘟病毒检测，则是需要根据检测要求，创设一个适合构建检测设施的必要环境。应用荧光PCR方法检测非洲猪瘟病毒，需要构建一个实验室，还要求这个实验室，必须是能够形成彼此独立，又要实现隔离的三个区域，即核酸提取室、试剂准备室和扩增分析室。三个实验区域的隔离程度，在它们之间，都不能实现空气的直接相通。进行这样严格的隔离，主要是为了预防出现交叉污染，以免影响对非洲猪瘟病毒检测结果的准确性与正确性[1]。

2 严格管护非洲猪瘟病毒的样品

非洲猪瘟病毒样品本身就潜在比较强的危险性，需要对它们进行灭活、离心、研磨与剪碎等一系列必要程序的处理。同时，在处理非洲猪瘟病毒样品时，还必须要在二级生物安全柜当中，安全地实施处理。处理过程，一定要切忌将非洲猪瘟病毒液体，溅到生物安全柜上，以防在生物安全柜上留下残液，出现非洲猪瘟病毒样品之间的交叉污染问题。不仅如此，还要管护好装有非洲猪瘟病毒样品的离心管，必须要盖严密封离心管，严禁非洲猪瘟病毒液体出现外泄问题。

3 正确应用检测仪器

进行非洲猪瘟病毒荧光PCR检测，需要应用的检测设备或仪器，主要有微量移液器、核酸提取仪、二级生物安全柜、冷冻离心机和荧光PCR仪等。在应用这些检测设备或仪器以前，一定要对它们实施必要的定期功能性检查、检定与校准，用以保证这些设备或仪器，是处在一种正常的使用状态之下。尤其要保持荧光PCR仪的清洁性，严禁荧光PCR仪存在一些污染物、杂物或灰尘。在实验室的三个区域之间，一定要保证它们使用的专用性，尤其要严禁调换使用移液器，挪用实验设备或仪器[2]。

4 精心处置和使用试剂

进行非洲猪瘟病毒检测，必须要使用必要的试剂。如果使用的是一种商品试剂盒，在接收到试剂盒以后，必须要将这样试剂盒内的阳性对照，放在实验室的核酸提取室当中，并将荧光PCR预混液，也要放在实验室的试剂准备室当中。因为试剂盒内的阳性对照，它们绝大多数都是重组质粒或高浓度的阳性样本，其本身就潜在较大的危险性。正是因为这样，在开盖吸取这些标本的时候，操作人员一定要慎之又慎，并倍加小心，因为如果一旦出现一些溅洒现象，将会提高非洲猪瘟病毒样品标本的污染性，进而会严重影响到非洲猪瘟病毒检测结果的准确性与正确性。

5 特别注意防范性操作

开展非洲猪瘟病毒检测工作，必须有专业人员进行检测操作。这样，就需要对具体实施检测的操作人员，开展系统的上岗培训工作，并坚持培训考核，通过考核合格以后，进行持证上岗。同时，即使是专业检测人员也要建立高度的预防检测污染意识，并具备高超的检测操作技能。检测人员由此实验区域到彼实验区域，都必须要注意及时更换防护用品。如果是在核酸提取室内进行检测过程操作，要戴好一次性口罩、手套和帽子，并要做到对它们进行勤换，以防造成污染。如果要对荧光PCR管进行封盖处理，操作人员必须要使用一次性的PE手套实施操作。

6 实施严格的实验检测操作

6.1 实验检测必须遵循的原则

检测人员进入试验区，必须要按照单一方向的行进程序，主持具体的实验检测，即由试剂准备室，到核酸提取室，再到扩增分析室。在每个试验区，一定要设置好非常明显的警示或提示标志。各实验区域还要必须保持高度清洁，严禁将各个试验区的实验设备、仪器或物品混用。当实验检测操作人员需要离开实验检测区域时，切忌将工作服带出实验区域[1]。

6.2 正确操作预混与试剂的分装

扩增所需要的试剂，需要在紫光灯照射环境下的负压工作台或超净工作台上，进行配置与分装，并需要对荧光PCR预混液，进行小量的分装，还要将分装好的荧光PCR预混液，保存在-20℃的环境之中。在进行荧光PCR预混液分装时，也要尽可能减少重复加样的频率次数，用以减少造成污染的机会。在分装预混液和试剂的过程中，仅需应用试剂准备室中的移液器以及Tip头，一定要禁用其他实验区域的移液器和Tip头，意在预防发生污染现象。

6.3 规范进行核酸提取加样

凡是参加非洲猪瘟病毒检测的操作人员，都必须根据试剂盒上的说明书或作业操作指导书所提示的步骤，进行严格的操作，预防非洲猪瘟病毒标本或试剂遭到气溶胶的污染。同时，具体检测操作人员，必须要戴一次性手套，如果被戴的一次性手套上，不管是什么原因被溅上了相应的反应液，必须要立即更换新的一次性手套。如果检测操作需要打开离心管，又必须需要检测操作人员运用双手，打开离心管。在开启离心管时，动作一定要轻，也要用又缓劲，意在预防液体被溅出。假若溅到了手套或桌面上时，不但要及时更换手套，还要用稀酸对桌面进行快速的擦拭。如果用移液器吸取液体或进行加样时，同样要加倍小心，既要进行慢慢地吸，又要一次性吸完，以防出现交叉性污染或形成气溶胶污染，并且要在最后一道操作程序，加阳性对照，用以降低阴性对照或标本的污染几率。当加入核酸以后，又必须要即刻盖紧管盖，用以规避在样品之间出现交叉污染现象。

6.4 进行扩增分析

进行非洲猪瘟病毒样品扩增分析，需要在扩增分析室内进行，具体操作人员要尽可能减少不必要的走动，意在规避气溶胶性的污染。在应用荧光PCR实施非洲猪瘟病毒扩增分析时，它并不需要进行电泳。当经过扩增后已经使用过的反应管，绝对不能再使用，需要直接对它们进行必要的无害化处理。对反应管的处理，要么进行焚烧，要么进行深埋，绝不允许草草地处理，以免出现污染后患。

6.5 必须做好试验区的清洁工作

当对非洲猪瘟病毒实验检测过程完成以后，一定要用次氯酸钠或紫外灯进行照射，以这样的消毒方式，将实验检测用过的工作台面，进行比较彻底地消毒，然后再用70%的乙醇或清水，对次氯酸钠进行彻底地清洗。在应用紫外灯照射方式进行消毒清洁时，需要将紫外灯光照射的波长，至少调整到254nm，进行紫外线照射消杀。如果是对实验工作台面进行紫外线杀毒，需要将紫外线灯放在距离实验工作台面的60～90cm的间距上，进行紫外照射杀毒。对于应用荧光PCR方法检测非洲猪瘟病毒工作完成以后，针对检测区域的善后处理消毒工作，不可轻视或大意。因为在检测操作场地或区域，比较容易留下残余，如果不能通过必要有效的消毒或杀毒，往往容易留下隐患或后患，一旦有非洲猪瘟病毒残留，将会造成严重后果。

7 结语

应用荧光PCR方法检测非洲猪瘟病毒，是目前比较有效的一种检测方法。因此，国家有关主管部门发布了针对非洲猪瘟病毒的检测方法。应用荧光PCR方法检测非洲猪瘟病毒，它的最大优势是能体现检测结果的正确性与准确性。严格讲，针对传染性病毒的检测，需求的就是检测结果的正确性与准确性。如果没有检测结果的正确性和准确性，不但会贻误非洲猪瘟的有效预防或控制，还会造成病毒的传播或蔓延，造成的后果将难以想象。因此，只有检测结果具有正确性或准确性，才能根据检测结果情况，采取针对性措施，遏制非洲猪瘟病毒泛滥。但这种检测法，同样有其一定弊端，即它最忌讳出现各种直接性或间接性污染现象，因其能严重影响检测结果。并且，它对检测环境或条件要求较高，需要构建专属实验检测场所或实验室，并需进行各检测区域间的严格隔离，其检测成本比较高。尽管如此，还要应用这种方法进行检测，只要能特别规避污染现象发生，仅有检测成本的投入，相比非洲猪瘟病毒成本造成的损失，几乎不成比例。