植物内生菌功能及应用研究

曹 阳 胡月 刘 彬

（黑龙江农业经济职业学院，黑龙江 牡丹江 157000）

1.植物内生菌的定义

内生菌一词是由植物病理学之父De Bary在1866年首先提出，是指生活在植物组织内的微生物，用以区分那些生活在植物表面的表生菌。现在被定义为能够在植物内部定殖而不引起宿主致病的微生物。内生菌种类丰富，包括细菌、真菌、放线菌。内生菌在控制病原菌，促进植物生长，新化合物的合成等方面有很好的应用。

2.植物内生菌多样性

植物不是单一微生物的宿主，而是同时宿主许多不同的有机体，它们统称为内生微生物组。内生微生物组是多样的，包括内生细菌、内生真菌以及内生放线菌。宿主植物不同，其内生菌的种类和数量也存在差异，同一宿主植物在不同组织中内生菌的分布及其丰度也有所差异。很多内生菌虽然在形态学上没有较大差异，但是其内生菌的遗传型却不尽相同，从而丰富了内生菌的多样性。目前研究较多植物物种有小麦、大豆、棉花，马铃薯等。已分离出的内生真菌，大多数的内生真菌是子囊菌类。而分离的内生细菌已经超过了129种，有50多个属，主要有芽孢杆菌属、单胞菌属、泛生菌属、假单胞菌属等。植物内生放线菌主要的种类为链霉菌属等。地球上内生菌的种类100万左右，然而目前记载的植物内生菌尚不足1/10，植物内生菌的研究任重而道远。

3.植物生防内生菌分离

植物生防内生菌的分离筛选过程：（1）在病害压力地区对健康植物进行取样。（2）利用人工培养基从表面无菌组织中分离。（3）利用核糖体基因对分离物进行分子鉴定。（4）定殖效率和大规模生产试验可以减少潜在分离菌的数量，以及发现潜在的病原体。（5）温室内进行植物内生菌对植物的筛选试验。（6）成功的分离菌可以在大田条件下进行大规模试验，以评估田间的一致性。（7）潜在的生防内生菌可以进入工业阶段或大规模生产和销售。

许多研究人员通过分离可培养微生物并测试其潜在的生防功能，寻找潜在的生防菌。通常采用体外对抗试验，通过测定抑制目标病原体生长的能力，即直接抗菌活性寻找潜在生防菌。从生境中寻找健康的植物，从植物上分离出新的内生菌，它们可以与病原体相互作用，为了检验从一些环境中分离出来的内生菌更有可能适应这些特定的环境条件（例如，温度、紫外线辐射、竞争生物等），之后可以进行小规模的田间试验，以评估疾病症状的发展，并优化时间点和应用方法。

从植物中筛选出的内生微生物对寄主植物的适应性特别好，因为它们至少在其生命周期的一部分在植物组织内部定居，而不会造成任何直接的、明显的负面影响，国内外学者对内生菌分离筛选并进行相关的应用进行了全面而深入的研究。革兰氏阳性蜡样芽孢杆菌REN3和REN4从水稻根际和根中分离得到，实验证明具有促进水稻生长和抑制水稻病原真菌生长的特性。一种拮抗枝孢菌的分离物从一种产孢菌的黑曲霉菌落中分离出来，在田间被证明与杀菌剂一样有效控制苹果疥疮。有研究表明从工业和城市污水灌溉玉米根际土壤和根系中分离的可培养根际和内生细菌对重金属和盐分的抗性和植物生长促进（PGP）特性，结果表明，大量细菌分离株（包括内生细菌和根际细菌）对重金属具有耐受能力。

4.植物内生菌功能

4.1 增强植物抗病性

内生菌能够增强植物宿主对病原生物的抗性，保护宿主免受危害。近年来，随着内生菌研究领域的不断深入，内生菌作为潜在的生防资源方面成为了国内外研究的热点。内生菌增强植物的抗病性可能机理主要表现在以下几个方面：激活自身防御系统诱导抗性；重寄生作用; 通过抗菌物质直接抑制；争夺空间和营养。通常，不同内生菌的生防机制有所差异，或单独发挥作用或几个机制同时作用。通过获取营养物质（氮、磷和必需矿物质）或调节植物激素水平促进生长也可以改善植物的整体健康，从而保护植物免受疾病。

4.1.1诱导抗性

诱导抗性是植物防御机制共同作用的结果。为了使植物不受病原侵染，大量的防御反应被激活，包括加强结构性障碍，抗微生物代谢物的生产，合成和分泌的抗病原体的蛋白质，包括防御酶与抗菌蛋白。诱导植物反应的内生植物衍生化合物，能够识别外来特定的微生物成分。一旦认定这些化合物是潜在的有害微生物，就会诱导防御反应。植物对病原菌和内生菌的反应比较表明两者的识别方式相同，但在诱导防御反应方面有所不同。因此，诱导抗性很可能是内生菌在疾病控制中最重要的机制之一。这些能够诱导植物产生抗性的化合物，有些在所有内生菌中都是普遍性的，如细胞壁成分几丁质和β-葡聚糖，而有些则是具有有特异性的化合物，包括分泌蛋白、某些脂类和专门的代谢物、具有激素作用的分子和挥发性化合物。感染和定植过程中分泌的酶，如木聚糖酶、纤维素酶和几丁质酶，可被宿主直接识别或通过其降解产物诱导防御反应。在致病和内生定殖过程中分泌的真菌效应蛋白，如一些富含半胱氨酸的小分子蛋白质，通过调节防御反应和生理来促进与宿主植物的相容性。

典型的系统抗性主要分为两种类型，系统获得性抗性（SAR）和诱导性系统抗性（ISR）。大量研究表明，生防菌通过刺激植物自身的ISR反应来增强植物抵抗病原菌的能力。而ISR反应主要特征是植株体内活性氧变化，这与植物自身SOD、POD和CAT等相关抗逆酶活力息息相关。Mahunu等研究结果表明植物酸联合酵母菌降低了由青霉菌引起的苹果病害，并增加了CAT，POD，PPO防御酶活性。孙润红等研究了生防菌枯草芽胞杆菌YB-05对小麦抗病性相关防御酶的诱导作用，结果表明，小麦经生防菌处理后，叶片和根部与植物防御抗病相关的PPO、POD、SOD、PAL、CAT防御酶活性均比对照组高。

4.1.2 重寄生作用

重寄生是指包含了一系列情况的连续体，从宿主存活并从宿主细胞内获取营养的生物营养相互作用，到寄生体杀死宿主以死亡细胞生存的死性营养相互作用。因为在培养皿中比在植物上更容易观察到寄生的迹象，所以证实真菌寄生行为的研究通常是在体外进行的。借助各种显微镜技术，可以看到寄生体和寄主之间的直接相互作用。真菌可以直接接触，渗透进被寄生的菌丝，缠绕在菌丝周围，最终导致猎物菌丝的破坏。Donayre和Dalisay研究了一种从牧草中分离出来的内生真菌Geotrichum sp.对水稻纹枯病菌的寄生作用。国内有研究者检测了从芦苇中分离出来的内生真菌，可以对抗土壤传播的病原菌，在显微镜下可观察到菌丝缠绕在病原菌菌丝周围，细胞质降解。

4.1.3 产生抗菌物质

抗生素指的是生防菌直接产生的对病原体的有抑制作用的化合物。人们已经鉴定和开发了一些生防菌代谢物，并研究了一系列不同化合物对植物病原的抑制活性。从内生菌中分离出了大量具有抗菌活性的天然产物，包括生物碱、黄酮类、甾体、萜类、多酮类以及挥发性有机化合物，其中萜类和多酮类是目前对内生真菌抗菌活性研究最多的代谢物，代谢产物可以在植物体内从内生菌转移到病原感染的部位。目前研究较多的是关于内生菌生产特定代谢物的能力和内生菌培养物或粗提物对病原体的抑制作用。

4.1.4 争夺空间和营养

有益内生菌和致病菌争夺营养和空间，也是一种可能的机制，通过其栖息的内生植物可以防止宿主的侵染病原体。内生菌可以在局部或系统地、细胞间或细胞内定植不同的植物组织。通过快速定植和清除可用的营养物质，它们占据了原本可能被病原微生物利用的生态位，从而在满足自身的营养条件需求的情况下，又减少了病原菌入侵的可能性。有研究发现从可可树叶片上分离的内生菌叶面施用到幼苗上可以局部减轻叶片上疫霉菌的病害症状，这些表明竞争是一种机制。然而，体外对抗试验也显示了所选菌株产生的代谢物，表明竞争可能不是唯一的机制。

4.2 促进植物生长

大多数植物内生菌具有直接和间接的机制促进植物生长的作用。在植物的生长过程中，一些内生菌的生长代谢会产生植物生长激素、细胞激素，能够直接对宿主植物的生长起到促进的作用，如吲哚乙酸、细胞分裂素、磷溶解，钾溶解等，通过生物固氮增强宿主的可攻氮可用性，吲哚乙酸在植物中发挥着关键作用，通过不同水平的吲哚乙酸产生刺激细胞伸长、种子萌发和幼苗生长。在间接机制中，内生菌产生的次生代谢产物，如铁载体、抗生素、酶这些物质能够间接地促进植物的生长。许多细菌内生菌具有产生铁载体的能力，铁载体与铁离子螯合成可溶性复合体，当这些复合物被转移到细胞中时，它们会被水解，铁被还原从而被植物吸收。纤维素酶和蛋白酶对提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性很重要。

4.3 天然药物资源

内生菌是具生物活性化合物的来源之一，在医药等领域都具有重要的意义。研究证实，内生菌与宿主植物在协同进化过程中，内生菌及其次生代谢物能产生与宿主植物相同或相似的活性成分。近年来，从植物内生菌中分离出的药用活性成分不断增加，包括酯类、多糖、二萜类、醌类、黄酮类、生物碱类等物质。在1990-2010年期间，已有超过100种抗癌化合物从内生真菌中被描述。此外，Govindappa等人从植物组织中分离出链格孢菌的凝集素，发现内生真菌凝集素具有较强的抗糖尿病作用。2017年，Uzor等研究了内生真菌黑孢菌中的活性物质脱落酸的抗糖尿病作用，结果表明可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖。国内文献报道从乌拉尔药用植物中分离筛选出多种内生菌，体内及体外均表现出有抑菌作用，并对小鼠有镇咳、祛痰作用。这些研究表明，植物内生菌在新药的研发及技术方面都具有较大的开发潜力。

5.内生菌在植物上的应用

内生菌种类繁多，最常见的有芽孢杆菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德菌属、泛菌属等，这些内生菌与植物相互作用中发挥着有益的作用。利用全基因组测序方法对内生菌在植物病原菌生物防治方面的潜力研究表明菌株能产生抗菌素，具有抗菌活性。Contreras-Pérez等在体外生物测定中，内生菌株B. toyonensis COPE52显示出对灰霉病植物病原灰霉病菌的抗真菌作用。此外，菌株COPE52在温室条件下对蓝莓植株的生物量和叶绿素含量均有促进作用。2008年张铎等利用平板对峙试验证明内生菌BSD-2具有较强的抑菌活性，利用硫酸铵沉淀拮抗物粗提液，并证明该提取物具有良好的热稳定性、酸碱稳定性、耐蛋白酶性、对氯仿敏感，能够有效抑制V.dahliae孢子萌发。2012年王兰英等从南药植物砂仁中分离出一株对水稻纹枯病防效作用理想的内生菌属于芽孢杆菌属的菌株SRJ2-4，发现该菌株对水稻纹枯病的防效作用在盆栽和田间的防效效果分别是80.7%和79.4%，同时该菌株还能增加水稻的产量，每亩产量为488.79kg。2018年赵媛等以对叶红景天（Rhodiola subopposita）为研究对象，从根、茎、叶中分离得到24株对叶红景天内生菌，其中有12株菌对蚕豆荚枯萎病病原菌、菜豆黑斑病病原菌、茄镰刀菌有不同程度的抑菌作用。2018年陆蓝翔等利用组织切片法、组织匀浆法从健康樟树组织中分离出的巨大芽孢杆菌ZS-3具有一定的抗病促生的作用。

6.展望

一方面从植物内生菌体内提取的相关次生代谢产物具有抗菌、促生长、抗病毒、抗氧化等很多功能；另一方面，植物内生菌通过生物固氮、调节植物激素等作用促进宿主植物的生长和产量增加，有利于病虫害生物防治、污染土壤的生物修复，有利于减少化学药剂的使用，促进全球农业可持续发展。然而，相比发达国家，我国在植物内生菌方面的研究和应用还存在着一定的差距，这就需要我们朝着更深的方向研究和探索。