猕猴桃果实软化过程中细胞壁多糖物质含量与果胶降解相关酶活性变化

陆玲鸿，马媛媛，古咸彬，肖金平，宋根华，张慧琴

(浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州310021)

果实成熟是一个非常复杂的遗传调控过程，伴随着生理、生化、物理和风味的变化[1]。猕猴桃属于呼吸跃变型果实，采后极易变软腐烂，不耐贮藏[2]。猕猴桃果实后熟软化分为软化起始、快速软化、可食和过熟4个阶段[3]。研究表明，不同猕猴桃种或品种有相似的果实软化进程，但是有不同的果实软化速率[4-9]。美味猕猴桃一般较中华猕猴桃软化速度慢，更耐贮藏；软枣猕猴桃软化最快，货架期最短。软枣猕猴桃营养丰富，即食性好，已经开始规模化栽培，发展迅速[10]，但其低温贮藏期仅为1～2个月；美味猕猴桃海沃德在0 ℃的贮藏期为4～6个月[11-12]。

细胞壁组分与结构的变化是导致猕猴桃果实软化的关键因素。细胞壁主要包含多种多糖组分，如果胶、纤维素和半纤维素[13]。果胶是结构最复杂的植物细胞壁多糖，在细胞与细胞的黏附中起重要作用。在番茄和许多其他肉质水果中，一些与成熟相关的最显著的变化发生在果胶多糖中[14]。研究表明，猕猴桃果实中果胶聚合物和半纤维素的解聚与降解可导致细胞间隙增大和细胞壁结构松动，从而引起猕猴桃果实后熟软化[15]。

果胶聚合物在果实成熟过程中的降解是几种果胶代谢酶作用的结果，其中主要包括果胶甲酯酶(pectin methylesterase，PME)、内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-polygalacturonase，PG)、果胶酸裂解酶(pectate lyase，PL)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，α-AF)等[14，16]。研究表明，果实软化是多种果胶降解酶综合作用的结果，同种果胶降解酶在不同物种的果实软化中具有不同作用。现有的研究主要围绕美味猕猴桃品种展开[17-21]，尚未有对不同贮藏条件、不同种猕猴桃果实细胞壁多糖物质与果胶降解酶的相关研究。有研究表明，PL是影响番茄果实软化的一个重要因素，但目前对猕猴桃果实PL活性的研究较少[22]。本研究以徐香、金丽、晚绿3个品种猕猴桃果实为试材，测定25 ℃和4 ℃贮藏过程中不同猕猴桃果实的硬度、细胞壁多糖物质含量和果胶降解相关酶活性，并对其进行相关性分析，为猕猴桃果实采后软化机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为商业采收期采摘的3个品种猕猴桃果实，即徐香、金丽和晚绿(图1)。3个品种果实分别采自浙江仙居、丽水和新昌的实验基地。徐香是市场上畅销的美味猕猴桃(Actinidiadeliciosa)品种；金丽和晚绿分别是浙江省农业科学院选育出的中华猕猴桃(Actinidiachinensis)和软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)品种。果实采收当天挑选大小均匀、成熟度一致、无病虫害和机械损伤的果实，均匀地平铺在纸箱中，用保鲜膜包装后分别放置于25 ℃和4 ℃、相对湿度(90±5)%的环境中。贮藏期间，25 ℃贮藏组中徐香和金丽猕猴桃果实每3 d取样1次，晚绿猕猴桃每2 d取样1次；4 ℃贮藏组每周取样1次；果实硬度低于0.35 kg·cm-2或晚绿猕猴桃果实表皮褐化率50%以上时停止取样。猕猴桃果肉用液氮速冻后置-80 ℃冰箱保存待测，每个重复取用8个果实。

图1 三个品种猕猴桃果实形态特征

1.2 测定指标与方法

1.2.1 硬度测定

在果实赤道部位均匀取3个点，削去约1 cm2果皮，用FHM-1果实硬度计(竹村，日本)测定硬度，以kg·cm-2表示。每品种随机测量6个果实，结果取平均值。

1.2.2 细胞壁物质组分测定

细胞壁物质的提取和分离参考Figueroa等[23]的方法。半纤维素含量测定用蒽酮法[24]，用葡萄糖作标准物质，单位mg·g-1；用重量法测定纤维素含量，单位mg·g-1。不同溶解性果胶含量测定参考曹建康等[24]的方法，单位mg·g-1。以上数据都以鲜重计。

1.2.3 酶活性测定

用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，并采用上海科兴生物科技有限公司的ELISA试剂盒进行酶活性测定。每样品重复3次，数据以蛋白质质量计，单位U·g-1。

1.3 数据处理

用Microsoft office 2019软件进行数据统计、分析与绘图，利用SPSS 26.0软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃果实采后硬度的变化

硬度是评价果实软化的重要指标。在25 ℃和4 ℃两种贮藏温度下，3个品种猕猴桃果实硬度都随贮藏时间延长而下降(图2)。25 ℃贮藏条件下，晚绿硬度下降最快，4 d时硬度已下降84.62%；其次是金丽，6 d时，硬度下降77.7%；徐香硬度变化最为缓慢，6 d时硬度仅下降45%，9 d时下降69.79%。4 ℃贮藏条件下，晚绿果实硬度呈直线型下降，金丽和徐香果实硬度均在前3周快速下降而后缓慢变化，而徐香硬度始终保持最高。4 ℃低温贮藏延缓了猕猴桃果实的软化，延长了贮藏期限。

图2 猕猴桃果实软化期间果肉硬度变化

2.2 猕猴桃果实采后细胞壁多糖物质的降解

两种贮藏条件下，猕猴桃果实细胞壁物质含量呈不断下降趋势(图3)。0 d时，3个品种猕猴桃细胞壁物质含量从高到低依次为徐香、晚绿、金丽。25 ℃贮藏条件下，3个品种猕猴桃细胞壁物质含量在贮藏前期下降速度不同，晚绿的细胞壁物质含量下降最快，贮藏2 d时已下降38.44%，而金丽和徐香在贮藏3 d时分别下降32.11%和13.61%；徐香的细胞壁物质含量始终高于其他两个品种。4 ℃贮藏条件下，3个品种猕猴桃细胞壁物质含量均在贮藏前期快速下降，贮藏3周时，晚绿、金丽和徐香猕猴桃细胞壁物质含量分别下降39.01%、43.17%和38.12%。4 ℃低温贮藏延缓了猕猴桃果实细胞壁物质的降解。

数据以鲜重计。图4、图5同。

3个品种猕猴桃果实贮藏期间半纤维素含量呈不断降低趋势(图4)。0 d时，3个品种半纤维素含量从高到低依次为徐香、金丽、晚绿。两种贮藏温度下，不同品种猕猴桃果实半纤维素含量均在贮藏前期快速下降，随后缓慢降低。在整个贮藏过程中，徐香果实的半纤维素含量始终较高。25 ℃贮藏末期，徐香、金丽、晚绿的半纤维素含量分别为1.06、1.00、1.25 mg·g-1。4 ℃贮藏末期，金丽和晚绿的半纤维素含量较25 ℃贮藏末期分别增加43%和103.2%，徐香的半纤维素含量无明显变化。纤维素含量与半纤维素含量变化趋势较为一致(图4)。4 ℃低温贮藏延缓了猕猴桃果实半纤维素和纤维素含量的下降。

图4 猕猴桃果实软化期间半纤维素和纤维素含量的变化

如图5所示，0 d时徐香、金丽、晚绿的水溶性果胶(water soluble pectin，WSP)含量分别为0.86、0.57、1.29 mg·g-1。25 ℃贮藏条件下，晚绿的WSP含量在贮藏前期快速增加，贮藏4 d达4.43 mg·g-1；金丽和徐香的WSP含量增加相对缓慢，贮藏末期其WSP值显著低于晚绿。4 ℃贮藏条件下，晚绿WSP含量呈直线上升，金丽和徐香的WSP含量则在贮藏前2周迅速上升，随后缓慢上升直至贮藏末期。不同品种猕猴桃果实贮藏期间离子结合型果胶(ionic soluble pectin，ISP)含量变化趋势较为一致。0 d时，徐香的ISP含量最高，晚绿的ISP含量最低。25 ℃贮藏条件下，金丽和晚绿的ISP含量呈先升高后降低的趋势，徐香的ISP含量相对稳定，在贮藏后期有所降低。4 ℃贮藏条件下，3个品种猕猴桃的ISP含量均呈现先升高后降低再升高的波动变化趋势，徐香的ISP含量始终保持最高。3个品种猕猴桃采后共价型果胶(covalent soluble pectin，CSP)含量均不断减少。25 ℃贮藏条件下，晚绿的CSP降解最快，在贮藏2 d时已下降46.49%，而金丽和徐香在贮藏3 d时分别下降16.08%和31.97%；金丽的CSP含量在贮藏3 d后呈直线下降趋势，而徐香呈缓慢下降趋势。4 ℃贮藏条件下，3个品种猕猴桃的CSP含量均在贮藏前2周降低最多，徐香的CSP含量始终保持最高。4 ℃贮藏显著减缓猕猴桃果实CSP含量的下降。

图5 猕猴桃果实软化期间果胶含量的变化

2.3 猕猴桃果实采后果胶降解相关酶活性

不同品种猕猴桃果实贮藏过程中PME活性变化趋势不同(图6)。25 ℃贮藏条件下，金丽和晚绿的PME活性呈先升高后降低趋势，分别在贮藏3 d和4 d达到峰值；徐香的PME活性呈先稳定后上升的趋势。4 ℃贮藏条件下，晚绿的PME活性在整个贮藏过程中不断增加；金丽和徐香的PME活性在贮藏1周时显著增加，随后呈波动变化趋势。

如图6所示，25 ℃贮藏条件下，金丽和晚绿的PG活性在采后呈先升高后降低趋势，晚绿的PG活性相对较高，贮藏4 d已达峰值，是金丽活性峰值(6 d)的1.17倍；徐香的PG活性在贮藏前期保持稳定，于12 d时达到最高值。4 ℃贮藏条件下，3个品种猕猴桃果实均在贮藏前期保持较低的PG活性，在贮藏后期活性升高，低温抑制猕猴桃果实PG活性的上升。

不同品种猕猴桃贮藏期间PL活性变化趋势差异较大(图6)。0 d时，晚绿的PL活性显著高于其他两个品种。25 ℃贮藏条件下，晚绿的PL活性在采后2 d快速下降，随后又上升，其活性高峰不明显；金丽和徐香的PL活性总体呈先上升后下降的趋势，分别在贮藏6 d和9 d达到峰值。4 ℃贮藏条件下，晚绿的PL活性呈不断降低趋势，而金丽和徐香的PL活性在贮藏前期较低，于贮藏后期上升；在贮藏前3周，徐香的PL活性显著低于其他两个品种。

数据以蛋白质质量计。下同。

25 ℃贮藏条件下，晚绿和金丽两种糖苷酶活性均呈先上升后下降趋势，分别在贮藏4 d和6 d达到高峰；徐香β-Gal活性在贮藏前期相对较低，随后上升，酶活性高峰出现较晚(图7)。4 ℃贮藏条件下，3个品种β-Gal活性均呈现上升-下降-上升的波浪式上升趋势，α-AF活性在3个品种中表现不同；晚绿α-AF活性变化呈波浪趋势，金丽α-AF活性在前期快速增加随后保持稳定，而徐香则是缓慢上升趋势；在贮藏前3周，徐香α-AF活性显著低于其他两个品种。

图7 猕猴桃果实软化期间β-半乳糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性变化

2.4 猕猴桃果实硬度、细胞壁组分和果胶降解酶活性之间的相关性分析

表1相关性分析结果显示，两种贮藏条件下，3个品种猕猴桃果实硬度与WSP含量之间均呈显著负相关，与CSP、半纤维素、纤维素含量之间呈显著正相关，且相关性较强(0.868

表1 猕猴桃果实硬度、细胞壁组分和果胶降解酶活性之间的相关性

3 结论与讨论

果实软化是猕猴桃果实成熟的最主要特征之一，硬度则是评价果实软化最直观的生理指标。本试验中，3个品种猕猴桃果实软化速率不同，其变化速率从大到小依次为晚绿、金丽、徐香。猕猴桃果实软化过程中，细胞壁组分发生不同程度的降解。双子叶植物细胞壁主要由半纤维素、纤维素和果胶组成，上述物质降解是造成细胞壁结构破坏的主要原因，细胞壁结构变化进而导致果实质地发生改变。在两种贮藏温度下，3个品种猕猴桃果实半纤维素、纤维素和CSP含量不断降低，WSP含量不断上升，ISP含量相对稳定，与前人在猕猴桃中的研究结果一致[20，25]。此外，两种贮藏温度下，不同品种细胞壁组分降解速率不同，软化最慢的徐香猕猴桃降解速率最小，软化最快的晚绿猕猴桃降解速率最大，这与桃和番茄果实中的研究结果类似[26]。相关性分析结果表明，3个品种猕猴桃果实硬度与WSP含量之间均呈显著负相关，与CSP、半纤维素、纤维素含量之间呈显著正相关，说明猕猴桃果实软化与细胞壁多糖物质的降解紧密相关。

果胶物质是植物细胞壁初生壁和中胶层的主要成分，也是对猕猴桃果实软化影响较大的细胞壁多糖物质。果胶结构域主要包括同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HG)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅰ和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ[27]。果胶聚合物的溶解、解聚和去酯化是果实成熟最重要的特征，多种果胶降解酶参与其中。PME是一种水解酶，水解果胶分子HG中C-6甲酯化的羧基，形成果胶酸。PME为PG和PL提供去甲基果胶酸，促进其他果胶酶对果胶的去聚化；细胞壁中性糖尤其是β-Gal和α-AF分别催化的半乳糖和阿拉伯糖的释放丢失也是猕猴桃果实成熟软化过程中的一个重要事件。25 ℃贮藏时，金丽和晚绿PME活性分别在贮藏前期和后期达到峰值，徐香PME活性在贮藏前期活性最低，并呈现先稳定再上升的趋势。研究表明，金魁猕猴桃PME活性则在后期达到峰值，于贮藏末期有所下降[28]，而秦美猕猴桃的PME活性则一直处于下降状态，没有表现出阶段活性高峰[18，25]。4 ℃贮藏条件下，本研究中3个品种猕猴桃果实PME活性呈上升趋势，与海沃德猕猴桃[29]和秦美猕猴桃[19]中的研究结果一致，而与东红猕猴桃[30]中的研究结果不同，说明PME活性在不同品种猕猴桃果实中变化趋势不同。25 ℃贮藏时，PG和β-Gal活性与徐香猕猴桃软化显著相关。25 ℃贮藏前期，PG和β-Gal活性在软化最快的晚绿果实中最高，而在软化最慢的徐香果实中活性最低。4 ℃贮藏时，α-AF活性与徐香和金丽的果实软化显著相关，PL活性与晚绿果实软化显著相关。4 ℃贮藏前期，α-AF的活性在晚绿中最高，在徐香中最低，这与齐秀东等[31]对不同贮藏性梨果实和高萌等[7]对不同耐贮性猕猴桃果实中的研究结果一致。PL活性在猕猴桃中研究相对较少，有研究表明，PL在东红果实软化期间活性变化不明显[30]。本试验中，4 ℃贮藏前期，PL活性在晚绿中最高，在徐香中最低。

综上所述，3个品种猕猴桃果实软化与细胞壁多糖物质的降解紧密相关。晚绿猕猴桃软化最快，其细胞壁多糖物质含量变化也最快；徐香猕猴桃软化最慢，其细胞壁多糖物质含量变化也最慢。25 ℃贮藏条件下，贮藏前期晚绿中PG、β-Gal的高活性和徐香中的低活性是导致其软化速度差异的原因；4 ℃贮藏条件下，贮藏前期晚绿中PL、α-AF的高活性和徐香中的低活性是导致其软化速度差异的原因。