绿茶碎水提物对雏鸡肝脏组织学结构的影响

陈红雨,徐世骏,孙振国,张浩,余燕,马金友

（1.河南科技学院 动物科技学院,河南 新乡453003;2.华兰生物工程股份有限公司,河南 新乡 453003）

绿茶是我国重要的经济作物之一,产量居世界首位.主要的有机成分为茶多酚（20%～35%）、咖啡碱（3%～5%）、蛋白质（20%～30%）、糖类（20%～25%）以及少量氨基酸等[1].研究表明,绿茶在免疫系统中具有多种功效.它可以通过间接上调抗氧化酶的活性或直接作为助氧化剂促使氢过氧化物、羟基以及超氧阴离子的形成而发挥抗氧化功能[2-3];有报道表明,绿茶粉和茶多酚作为饲料添加剂均可以显著提高蛋鸡血清中超氧化物歧化酶和谷胱苷肽过氧化物酶活性[4];绿茶还能使肉鸡肝脏中的总抗氧化能力增强[5].绿茶还是天然的免疫调节剂.L- 茶氨酸被肠道吸收后的产物乙胺能够促进受病原攻击后T 淋巴细胞的增殖[6].日粮中添加不同剂量的茶多酚可以显著提高肉鸡的胸腺指数、血清中免疫球蛋白IgG 含量以及T- 淋巴细胞转化率与白细胞吞噬率[7-8].饲粮中添加英山云雾绿茶多糖缀合物提高了胸腺和法氏囊质量和血清中IgA 和IgG 浓度[9].此外,绿茶还具有广谱抗菌能力,它能通过干扰病原菌的代谢过程抑制自然界大多数病原细菌[5].

绿茶作为一种有着悠久历史的饮料,其安全性毋庸置疑.然而,近年来陆续有报道指出,绿茶及绿茶提取物可能会对动物和人类产生毒害作用.绿茶中的咖啡因被列入国家管制精神药品范围.EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）作为绿茶中含量最丰富且活性最强的物质,其急性、亚急性、亚慢性、慢性毒性试验以及临床病例都有报道[11].EGCG 单次腹腔注射为100～125 mg/kg 可造成肝毒性,为150～200 mg/kg 造成部分大鼠死亡.为500 mg/kg EGCG 在反复饲喂禁食的狗导致部分死亡,经检查显示肝坏死[12].给CF-1 小鼠禁食灌胃2 d 为750 mg/kg EGCG 即造成严重的肝毒性[13].而且,绿茶衍生制剂的实验室研究也揭示了高剂量绿茶制剂的毒性作用.比格犬口服TeavigoTM为500 mg/kg 可引起近端小管坏死和血清胆红素升高.给大鼠灌胃为2 000 mg/kg TeavigoTM可导致80%的死亡率[12].可见,绿茶发挥活性的剂量离其毒性剂量并不遥远[11].

目前,为了避免浪费,大量制茶过程中产生的副产品如茶碎等被用来当作饲料添加剂[14].所以,绿茶作为养殖业饲料添加剂探索其合适的添加量很有必要.目前对于绿茶负面作用的研究都是在啮齿动物和犬上进行,而对于雏鸡的研究鲜有报道.肝脏是动物体内以代谢为主的器官,也是重要的解毒器官.因此,本研究在雏鸡饲养过程中添加不同质量分数的绿茶碎水提物,研究其对肝脏的损害作用,以期在养鸡业中添加绿茶碎提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

绿茶碎购自河南信阳,雏鸡购买于新乡市古固寨孵化场.

1.2 动物饲养与取材

60 只1 d 龄健康817 雏鸡分六组,每组10 只,分别为对照组（C 组）,自由饮水摄食;T1 组,自由摄食,每天自由饮用10%绿茶碎水提物;T2-T5 组,自由饮水摄食,但每天清晨分别灌服含量1 mL/50 g 体质量10.00%、5.00%、2.50%和1.25%绿茶碎水提物,每天观察各组雏鸡的精神状态和摄食饮水情况.雏鸡若死亡,立马取肝脏,PBS 冲洗后置于质量分数为4%的多聚甲醛中保存备用. 饲喂7 d 后, 全部雏鸡腹腔注射戊巴比妥钠（1μg/1g）麻醉后,颈椎脱臼法处死,取肝脏,PBS 洗去血污后固定在质量分数为4%多聚甲醛中备用.

1.3 试验方法

1.3.1 石蜡切片、HE 染色将固定好的组织进行石蜡包埋,用石蜡切片机切成4 μm 切片,切片脱蜡复水后经过苏木精- 伊红染色,尼康显微摄影系统拍照并进行组织病理学观察.

1.3.2 Masson 染色试验 石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后按试剂盒说明进行操作（Masson 染色采用试剂盒购自南京建成科技有限公司）.

2 结果与分析

2.1 临床观察

T1 组和C 组雏鸡生存比较如图1所示.

图1 T1 组和C 组雏鸡生存比较Fig.1 Comparison of chick survival in T1 group and C group

T1 组雏鸡,第1 天和第2 天精神亢奋,第3 天开始精神沉郁,腹泻,采食量和饮水量明显减少,第4 天有个别雏鸡死亡,随后每天雏鸡死亡数量逐渐增加,直至第7 天雏鸡全部死亡.T2 组雏鸡1～7 d 精神状态良好,采食量和饮水量正常,第4 天出现轻微腹泻,直到第7 天仍腹泻,但存活率为100%.C 组和T3-T5 组雏鸡,1～7 d 精神状态良好,采食量和饮水量正常,存活率为100%.

2.2 绿茶碎水提物对雏鸡肝脏组织学结构的影响

不同处理组雏鸡肝脏组织学结构如图2所示.

图2 不同处理组雏鸡肝脏组织学结构Fig.2 Liver histological structure of chickens in different treatment groups

由图2可知,与空白组相比,T1 组雏鸡肝脏中央静脉充血且血液中淋巴细胞急剧增多,肝索结构紊乱、肝窦不明显,低倍镜下观察到大片淡粉色区域,高倍镜观察为胞质淡染、胞核消失,为坏死灶;T2 组雏鸡肝脏肝索和肝血窦结构清晰,但出现个别肝细胞水肿和局灶性坏死;T3、T4 和T5 组雏鸡肝脏没有明显变化.

2.3 绿茶碎水提物对雏鸡肝脏纤维增生的影响

肝脏Masson 染色如图3所示.

图3 肝脏Masson 染色Fig.3 Masson staining of the liver

由图3可知,与空白组雏鸡肝脏相比,T1 组肝索中有大量染成蓝色的纤维增生,T2 组肝小叶有轻微纤维增生,T3、T4 和T5 组肝脏无显著变化.

3 结论与讨论

在临床观察中,空白组和低质量分数绿茶碎水提物组对雏鸡无显著影响,高质量分数且大剂量会导致雏鸡精神先兴奋后萎靡,腹泻甚至死亡,这可能和绿茶碎水提物中的一些成分有关.先前的研究已经报道,咖啡因的一些代谢产物可以通过血脑屏障,不但影响动物精神状况,甚至还会对动物多个系统产生不同的毒性作用,例如,可以引起心率失常、无规则的肌肉活动、骨质疏松症、增加心脏病患者的心脏病发机率等[15].有研究用含曲茗绿茶量为10.9 g/kg、9.0 g/kg 灌胃小鼠,在20 min 后,小鼠均出现活动减少,呆滞,闭眼,萎靡不食,抽搐,强直震颤等表现,并在3～10 h 左右出现死亡高峰期,10～14 h 出现第二个死亡高峰期[16].临床上发现口服高剂量绿茶多酚提取物也出现副作用,例如肝中毒、恶心、腹痛和腹泻等,已被美国食品和药物管理局确认为肝毒性靶点[11].

在肝脏组织学结构观察中,T1、T2 组雏鸡相比于对照组肝脏发生了损伤, 说明高质量分数的绿茶碎水提物有肝毒性,这与肝脏是绿茶毒性靶点的研究结果一致[11].也有研究显示,每日单剂量EGCG1 500mg/kg可使雄性CF-1 小鼠血浆丙氨酸转氨酶（ALT）增加138 倍,降低存活率85%.每日一次EGCG 可增加肝毒性反应.每日两次750 mg/kg EGCG 剂量,血浆ALT 水平增加184 倍.口服EGCG 后观察到中度至重度肝坏死.EGCG 的肝毒性与氧化应激有关,包括肝脏脂质过氧化（增加5 倍）、血浆8- 异前列腺素（增加9.5 倍）以及肝脏金属硫蛋白和c- 组蛋白2AX 表达增加.EGCG 还能增加血浆白细胞介素-6 和单核细胞趋化蛋白-1 的含量[13].

在肝脏Masson 染色试验中,T1 组肝脏出现大片纤维增生,T2 组有轻微纤维增生,说明高质量分数的绿茶碎水提物造成雏鸡肝脏纤维的增生.肝纤维增生是肝细胞坏死并发生炎症刺激时,肝脏中细胞外基质（ECM）的增殖和降解失衡的病理过程,导致肝脏中纤维结缔组织异常沉积,它包括了肝细胞的凋亡、间充质细胞的增殖、细胞外基质中I 型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的沉积等[17-18].据推测,当肝细胞经历凋亡时,产生凋亡小体,这些凋亡小体被肝巨噬细胞,HSC（星状细胞）和肝细胞吞没,导致各种趋化因子和细胞因子的产生,例如巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）和TGF-β,这反过来又激活HSC 并导致肝纤维增生.正常肝脏对损伤的初始反应是肝细胞再生,如果肝脏细胞再生被阻断将导致肝脏纤维化[19-21].在游离脂肪酸、内毒素和高血糖等毒性作用下,肝细胞线粒体细胞色素P450ⅡE1 的表达升高,肝细胞内自由基显著增加,自由基可以氧化细胞膜脂质和蛋白质,从而改变细胞膜的结构和流动性,也可以使亚细胞结构膜上的多聚不饱和脂肪酸过氧化,细胞部分功能丧失甚至死亡,肝脏发生损伤.脂质过氧化终结产物丙二醛（MDA）与HSC 的NH2交联促进内皮细胞（ENC）的分泌,同时MDA 可与细胞内其他蛋白交联,活化HSC 自分泌和旁分泌TGF-β 和PDGF 因子而引起肝纤维化的启动,促进胶原纤维的合成、沉积、肝纤维增生形成[17].在世界范围内,器官组织纤维增生是引起疾病致残、致死的一个主要原因,主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多,实质细胞减少,持续进展可致器官结构破坏和功能减退,乃至衰竭,严重威胁动物健康和生命.尽管EGCG 历来被认为是一种抗氧化剂,在体外具有很强的自由基清除活性,但越来越多的数据表明,EGCG 的一些生物活性是由于氧化应激的诱导[22]. 添加超氧化物歧化酶可以稳定EGCG,防止EGCG 介导的活性氧的形成,从而抑制了这种作用,这表明它主要是由EGCG 介导的活性氧的形成而不是EGCG 本身驱动的.Galati 等[23]发现EGCG 诱导的氧化应激可能在EGCG 的毒性潜能中发挥作用.在用EGCG 处理新鲜分离的大鼠肝细胞后,通过荧光增加测量观察到细胞毒性和活性氧形成的时间依赖性增加.发现高剂量EGCG 具有毒性特征,尤其是肝毒性,并阐明其毒性特征归于其促氧化作用.由此推断高剂量绿茶碎水提物对雏鸡肝脏产生促氧化作用,从而产生更多的自由基导致肝细胞坏死,脂质过氧化终产物MDA 引起一系列反应,肝细胞胶原纤维增生,肝脏纤维增生引起雏鸡疾病乃至死亡.

有研究表明,EGCG 在大鼠中未观察到的不良反应水平的最高剂量为每日500mg/kg.该值与预先喂食的狗的无不良反应水平相同[12].杨贤强等[24]急性毒性试验结果显示小鼠灌胃茶多酚的半数致死量含量LD50＝2 496±326 mg/kg.按照2 400 mg/kg 进行计量换算,小鼠和成人之比为9.01∶1,雏鸡和成人之比为2 或3∶1,这里取2∶1,而且茶叶干质量中茶多酚的质量分数为24%[25],得出雏鸡的半数致死量含量LD50≈2 220 mg/kg.按照EGCG 灌服大鼠的安全剂量每日500mg/kg 来计算,大鼠和成人剂量换算比为6.3∶1,表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）,约占总儿茶素的59%,儿茶素约占多酚总量的70%～80%[26];所以,雏鸡饮用绿茶的安全剂量约为每日1 401mg/kg 换算后, 本试验采用的剂量为:T2 组为每日2 220mg/kg,T3 组为每日1 110 mg/kg,T4 组为每日555mg/kg,T5 组为每日277.5mg/kg.本研究结果显示T2 组和T3 组肝脏病变存在明显差异,T2 组肝脏病理学观察有肝毒性,T3 组与空白组结果更接近,说明EGCG 发挥活性的剂量离其毒性剂量并不遥远,因此雏鸡饲养中添加含绿茶副产品的剂量应低于2 220 mg/kg.此研究为生产中安全添加绿茶副产品提供了参考.