植物乳杆菌接种量对低盐风干肠品质特性及风味特征的影响

刘思婷，刘馨屿，王雯萱，王慧平，刘 骞，陈 倩，王 辉

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

风干肠是我国北方传统自然发酵肉制品，原料肉在微生物的作用下形成独特的色泽、质地及风味，深受消费者喜爱。食盐是干肠制品加工过程中必不可少的腌制材料，可以提供咸味、提升鲜味，同时有效抑制腐败菌和致病菌，保证产品品质及安全特性。由于风干肠在较长时间的风干和发酵过程中水分含量的降低，导致最终产品食盐含量高达3.6%～4.0%[1]。高食盐摄入量会增加患心脑血管疾病、中风、肾脏疾病等风险[2-4]。直接降低食盐添加量是减少钠盐摄入最为经济、有效的方法，但势必会影响风干肠发酵过程中微生物的生长及其代谢情况，进而对产品风味和品质产生一系列影响，还有可能造成亚硝胺、生物胺等潜在危害因素的增加[5-7]。

乳酸菌是发酵肉制品加工中的常用发酵剂，可以通过代谢产乳酸降低体系pH值和/或产细菌素抑制致病菌及腐败微生物的生长、产生胺氧化酶降解生物胺，保证产品安全性；还可以通过提高蛋白酶活性促进肉中蛋白质的分解，改善产品的质构特性；促进发酵过程中醛类、酮类、醇类和酸类等风味物质的形成，提升产品风味[8-11]。课题组前期研究表明，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是风干肠发酵过程中的核心菌株之一，对产品的品质提升和安全控制具有重要的作用[12]。

课题组前期的风干肠“减盐试验”发现，接种植物乳杆菌可有效改善低盐风干肠（食盐质量分数为1.75%）“咸香稍有不足”的缺陷，实现风干肠品质提升[13-14]，但其最佳接种量尚待研究。基于此，本研究将分离于自然发酵风干肠中的植物乳杆菌以不同接种量（105、106、107CFU/g）接种于低盐风干肠，探究发酵过程（发酵0、3、6、9 d）中其水分含量、水分活度、pH值、剪切力、肠杆菌数和乳酸菌数的变化，并在发酵结束时（第9天）采用电子鼻和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术综合分析植物乳杆菌接种量对风味的影响，结合感官评价确定最佳接种量，为低盐风干肠发酵剂的使用及品质提升提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪臀肉（瘦肉）、猪背膘（肥肉）、食盐、味素、葡萄糖、大曲酒 哈尔滨香坊区好又多超市；混合香辛料（桂皮、砂仁、丁香、肉豆蔻等）、猪小肠衣哈尔滨康泉食品商店。

MRS琼脂、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂 青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

ME204E电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DHG-9240A鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；FITOCLIMA 600PH恒温恒湿箱葡萄牙Aralab公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；AquaLab 4TE高精度温控水分活度仪 美国Decagon公司；PEN3电子鼻气味分析仪德国AirSense公司；TA-XT plus质构仪 英国SMS公司；GCMS-QP 2020 NX GC-MS仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂的制备

植物乳杆菌分离于自然发酵的哈尔滨风干肠，并于东北农业大学肉品加工实验室保藏，在MRS培养基中活化3 代后，将菌液在4 ℃、10 000×g离心10 min获得菌体细胞，备用。

1.3.2 风干肠的制备

参照Wen Rongxin等[1]的方法略作修改制备4 组低盐哈尔滨风干肠（食盐添加量均为1.75%）：将2 250 g猪臀肉和250 g猪背膘切成1.5 cm的肉块，加入43.75 g食盐、125 g水、0.25 g亚硝酸钠、25 g曲酒、25 g绵白糖、7.5 g味素、20 g混合香辛料。分别接种105、106、107CFU/g（记为LP5、LP6、LP7）植物乳杆菌，未接种的为对照组，充分搅拌后将4 组馅料分别灌入猪小肠衣中，制成直径约3 cm长度15 cm的肠，然后置于（25±2） ℃自然风干24 h，随后转移至（25±2）℃、相对湿度（65±5）%的恒温恒湿发酵箱中发酵9 d。分别于发酵第0、3、6、9天取样用于理化指标和乳酸菌数的测定，发酵第9天的样品用于气味、挥发性化合物种类及含量的测定并用于感官评价。

1.3.3 pH值、水分含量和水分活度的测定

将10.0 g切碎后的风干肠与90.0 mL去离子水混合，漩涡振荡混匀，静置30 min后过滤混合物。使用pH计测定pH值；参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[15]中的直接干燥的方法测定水分含量；将样品切碎后均匀铺满样品盒，使用智能水分活度仪测定其水分活度。

1.3.4 剪切力的测定

参照Lü Yichao等[16]的方法略作修改，将风干肠蒸制15 min后冷却至室温，修整样品保持切面平整，采用质构仪AMORS探头进行分析，测试前速率1.5 mm/s，测试速率1.5 mm/s，测试后速率5.0 mm/s。

1.3.5 乳酸菌总数和肠杆菌数的测定

在无菌条件下去除风干肠的外层肠衣、脂肪、结缔组织后切碎，取25.0 g切碎的样品与225 mL 0.85%无菌NaCl溶液混合后均质，使用9.0 mL 0.85%无菌NaCl溶液进行10 倍梯度稀释。将不同梯度的稀释液分别与MRS琼脂混合，置于（36±1）℃培养（48±2）h后测定乳酸菌数。与结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂混合，置于（36±1）℃培养（24±2）h后测定肠杆菌数，结果均以lg（CFU/g）表示。

1.3.6 电子鼻测定气味

参照Chen Qian等[17]的方法，取3.0 g切碎的样品置于顶空瓶，保持密封于室温平衡30 min，随后用电子鼻进行分析，测定10个传感器W1C（芳香成分）、W5S（氮氧化合物）、W3C（氨类）、W6S（氢化物）、W5C（短链烷烃）、W1S（烷烃类化合物）、W1W（硫化物）、W2S（醇类及醛酮类）、W2W（含硫有机物）和W3S（长链烷烃）对于挥发性化合物的响应值。传感器参数设置为：注入流速300 mL/min，分析时间60 s，冲洗时间60 s。

1.3.7 挥发性风味化合物的测定

采用顶空固相微萃取-GC-MS法[18]，将3.0 g均匀切碎的风干肠样品置于20 mL顶空样品瓶中，加入3 μL 100 mg/L邻二氯苯（内标物质），用丁基橡胶隔垫密封，45 ℃水浴振荡条件下平衡25 min，将50/30 µm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶的样品上方，45 ℃条件下萃取30 min。将萃取头置于GC-MS进样口解吸附3 min，采用GC-MS对挥发性化合物进行分析鉴定。

色谱条件：InertCap WaX惰性毛细管气相色谱柱（0.25 mm×60 m，0.25 μm）；载气为氦气，流速1 mL/min；解吸后，以5 ℃/min升温至200 ℃，然后以10 ℃/min的速率升至230 ℃后保持2 min。

将挥发性化合物质谱与NIST 17质谱库进行对比，相似度大于90%的作为定性结果。采用内标法对挥发性化合物进行定量分析，结果以µg/kg表示。

1.3.8 感官评价

熟制后的风干肠冷却至室温，切成5 mm左右的薄片，随机置于相同的白色托盘内，并用3 位随机数字进行标记。选取10 名具有肉品感官评价经验的人员，经培训后组成评价小组，对不同处理组的风干肠进行感官评定，对硬度（质地干硬7 分；质地松软1 分）、颜色（色泽红亮7 分；色泽暗淡1 分）、香味（干肠特有气味浓郁7 分；气味微弱1 分）、酸味（酸味过大7 分；酸味极轻1 分）、咸味（咸味过大7 分；咸味极轻1 分）和整体可接受性（接受性极佳7 分，接受性极差1 分）进行打分。对每个样品评价前需用清水漱口。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌接种量对低盐风干肠理化性质、乳酸菌数、肠杆菌数的影响

表1 不同植物乳杆菌接种量的低盐风干肠发酵过程中理化性质、乳酸菌数和肠杆菌数的变化Table 1 Changes in physicochemical properties, lactic acid bacteria count and Enterobacteriaceae count during fermentation of low-sodium dry sausage with different L. plantarum inoculum levels

如表1所示，发酵0～3 d，各组风干肠pH值显著降低，对照组、LP5、LP6和LP7的pH值由初始的6.42左右分别降至5.74、5.37、5.16和4.81（P＜0.05），这是因为发酵0～3 d时发酵环境适宜，接种的植物乳杆菌利用碳水化合物产生大量的乳酸，pH值大幅度的降低有利于抑制低盐发酵肉制品中腐败微生物及致病微生物的生长[19-21]。发酵6～9 d，对照组和LP7的pH值几乎不变，LP5和LP6的pH值呈现显著回升趋势（P＜0.05），这主要归因于肠体内腐败微生物产生的碱性生物胺[22]。结合肠杆菌数结果可知，对照组、LP5和LP6在发酵6～9 d时腐败微生物数量较多，导致其中生物胺含量可能相对较高，造成pH值呈回升趋势；而未接种的对照组微生物组成较为复杂且在发酵第6天时pH值较其他组高，所以其pH值几乎不变；另外，由于LP7接种量较高，发酵后期植物乳杆菌仍可产酸，同时抑制了腐败微生物的产胺作用，表现为pH值几乎不变。

在发酵0～6 d时，各组风干肠水分含量随着发酵的进行均呈降低趋势，但各处理组间差异不显著（P＞0.05）；发酵结束时，LP6和LP7水分含量高于LP5和对照组。各组风干肠水分活度的变化趋势与水分含量变化趋势相似，随着发酵时间的延长呈现显著降低趋势（P＜0.05）。发酵结束时，对照组和LP5、LP6和LP7的水分活度分别降至0.70、0.69、0.75和0.75，风干肠的细菌数量、细菌组成及其代谢均会引起pH值的变化，导致肌肉蛋白变性，进而影响蛋白空间网络结构，从而加速水分含量及水分活度的降低[23-24]。此外，各组风干肠的剪切力随着发酵的进行而增大，这可能由于发酵过程中水分散失以及食盐含量的升高导致质构的改变[25-26]。

发酵第0天，对照组、LP5、LP6和LP7的乳酸菌数分别为4.15、5.08、6.05、6.94 （lg（CFU/g）），这些微生物来源于原料肉及接种的发酵剂，其可通过降低pH值和产生细菌素抑制致病菌及腐败微生物的生长，还有一些乳酸菌被证明具有产胺氧化酶能力，可以降解生物胺提升低盐风干肠安全性[27-28]。发酵0～3 d，各处理组中乳酸菌数显著增加（P＜0.05），这是因为风干肠中水分含量较高，有利于乳酸菌增殖，LP5、LP6和LP7的乳酸菌数均在发酵第3天达到最大，对照组在发酵第6天达到最大，随后均呈现显著降低趋势（P＜0.05），这可能是由于发酵后期肠体中可利用的水分逐渐减少以及NaCl浓度升高对乳酸菌生长产生一定的抑制作用[29]。发酵第0天时，各处理组的肠杆菌数均在3.00 （lg（CFU/g））左右，主要源于原料肉及制作环境。对照组、LP5和LP6的肠杆菌数在发酵第3天增至3.89、3.85和3.79（lg（CFU/g）），随后均呈降低趋势；而LP7在整个发酵过程一直呈降低趋势，这可能是由于接种量107CFU/g时乳酸菌对肠杆菌抑制作用较明显。

2.2 植物乳杆菌接种量对低盐风干肠气味的影响

电子鼻是借助传感器模拟生物嗅觉系统，其可快速、高效地评估样品中挥发性风味的差异[30]。如图1A所示，传感器W6S、W1S和W2S对于风干肠样品中挥发性化合物的感应较其他传感器更强，说明样品中含有较多的氢化物、烷烃类化合物、醇和醛酮类物质。特别是传感器W1S和W2S可以区分出各处理组风味强度的差异。

为了进一步了解不同植物乳杆菌接种量风干肠的风味差异，对电子鼻传感器响应值进行PCA。由图1B可知，PC1的方差贡献率为83.9%，PC2的方差贡献率为13.6%，累计方差贡献率为97.5%。3个接种组相较于对照组距离均较远，说明接种植物乳杆菌对低盐风干肠整体风味影响较大。不同接种量的处理组在PC1上被很好地分开，接种量高的LP7位于PC1的负半轴，与W5C、W3C和W1C正相关；LP6位于PC1的正半轴，与W1S、W1W、W2S和W6S正相关。PC2能够很好地区分样品是否接种菌株，3个接种组均位于PC2的负半轴，对照组位于PC2正半轴，并且与W2W密切相关。

图1 不同植物乳杆菌接种量的低盐风干肠电子鼻分析雷达图（A）和PCA（B）Fig. 1 Radar plot (A) and PCA plot (B) of low-sodium dry sausages with different inoculum levels of L. plantarum at the end of fermentation based on electronic nose analysis

2.3 植物乳杆菌接种量对于低盐风干肠挥发性化合物的影响

由表2可知，发酵结束时，风干肠样品中共检出51种挥发性化合物，包括醛类、醇类、酮类、酸类、酯类和烯烃类等，它们主要来源于脂质氧化、氨基酸及碳水化合代谢、曲酒和香辛料[31-35]。虽然不同处理组含有诸多共有的挥发性化合物，但其含量差异较大。风干肠中共检测出9种醇类物质，其中乙醇含量最高，主要来源于两个途径：1）原料中曲酒的添加；2）乳酸菌的碳水化合物代谢，同时也作为底物参与酯类化合物的形成[36]。风干肠中共检测出3种醛类物质，作为重要的挥发性化合物，醛类在赋予发酵肉制品脂肪香味的同时还可以反映其脂肪氧化程度[37-38]。己醛含量随植物乳杆菌接种量的增加而显著降低（P＜0.05），这可能是由于植物乳杆菌对于脂质氧化的抑制作用[39]。风干肠中共检测出3种酮类物质，其中2-壬酮在3个接种组中均被检出而在对照组中未被检出，其主要源于微生物对不饱和脂肪酸的β氧化作用[12]。检出的酮类物质中小茴香酮含量最高，其主要源于香辛料的转化。风干肠中共检出8种酸类物质，酸类阈值较高，对风味贡献作用相对较小，但其可以作为重要的前体物质参与酯类的形成，影响发酵风味的形成[14]。其中，乙酸和丁酸主要来源于乳酸菌对碳水化合物的代谢，在所有处理组中均被检出，且随植物乳杆菌接种量的增加乙酸和丁酸含量呈上升趋势；辛酸主要由脂质氧化产生，接种组中含量均显著低于对照组（P＜0.05），这可能是由于接种植物乳杆菌降低了脂质氧化水平。风干肠中共检出11种酯类物质，主要来源于醇类和酸类的酯化反应，大多具有独特香气，可以赋予风干肠独特的果香及酒香[40-41]。与对照组相比，3个接种组中的戊酸乙酯和乳酸乙酯含量均显著升高（P＜0.05），LP6中的己酸甲酯和乙酸乙酯含量明显高于其他处理组，这可能与植物乳杆菌进行碳水化合物代谢提供更多的酸类物质作为底物参与酯类合成有关，还可能与接种量不同导致发酵过程中微生物组成差异及微生物酯化活性的差异有关[42]，这一结果表明接种植物乳杆菌有利于风干肠中酯类物质的形成。除此之外，还有大量烯烃（月桂烯和柠檬烯）及一些其他物质（丁香酚和茴香脑）来源于制作过程中添加的香辛料，并随发酵过程中水分的散失而浓缩。

表2 不同植物乳杆菌接种量的低盐风干肠中挥发性化合物含量Table 2 Volatile compound contents of low-sodium dry sausages inoculated with different inoculum levels of L. plantarum at the end of fermentationµg/kg

续表2 µg/kg

为进一步探究各处理组中挥发性化合物的差异，对挥发性风味物质进行PCA。如图2A所示，PC1的方差贡献率为42.1%，PC2的方差贡献率为30.8%，累计方差贡献率为72.9%。挥发性化合物主要分布于PC1和PC2正半轴，PC1和PC2与大多数挥发性化合物（醇、酸和酯）呈正相关。PC1能够很好地区分样品是否接种菌株，其中对照组独自位于PC1正半轴，与3个接种组距离较远，说明接种植物乳杆菌对挥发性化合物形成影响较大。PC2能够很好地区分不同接种量的处理组，LP6位于第2象限，与戊酸、乙酸乙酯和1-戊醇等挥发性化合物呈正相关。整体来看，4 组风干肠彼此之间距离较远，且分别具有其特征风味化合物。

为了确定不同植物乳杆菌接种量的风干肠中关键风味化合物，更准确地分析其差异，基于PCA结果进行PLS-DA。如图2B所示，4个处理组间相对距离较远，对照组位于PC1正半轴，3个接种组均位于PC1负半轴，与PCA结果基本一致，造成这一结果的主要原因是植物乳杆菌的接种量。然后对其VIP值进行计算，将VIP值大于1的风味物质视为对风干肠整体气味有较大影响的关键风味化合物[15]。如图2C所示，风干肠共有32种关键风味化合物，其中丁香酚、γ-松油烯、乙酸乙酯、1-辛烯-3-醇和丁酸乙酯在4个处理组中均有存在，对风干肠整体气味具有较大贡献。结合PCA发现（图2A），位于第1象限的γ-松油烯、1-辛烯-3-醇和丁酸乙酯，以及位于第2象限的乙酸乙酯、戊酸和庚酸等关键挥发性化合物均与LP6呈显著正相关。这一结果说明，LP6中的关键风味物质含量最为丰富。

图2 不同植物乳杆菌接种量的低盐风干肠中挥发性化合物的PCA（A）、PLS-DA（B）和VIP（C）值Fig. 2 PCA plot (A), PLS-DA plot (B) and VIP values (C) volatile compound contents of low-sodium dry sausages inoculated with different inoculum levels of L. plantarum at the end of fermentation

2.4 植物乳杆菌接种量对低盐风干肠感官评价的影响

风干肠发酵过程中pH值改变、脂质氧化和蛋白质水解，均会对风干肠感官特性产生影响[32,45-46]。如表3所示，各组风干肠样品的硬度、颜色和咸味均无显著差异（P＞0.05）。接种植物乳杆菌显著提高了风干肠的香味得分（P＜0.05），可能与乳酸菌对脂质和蛋白质的分解代谢产生的风味化合物有关。随着接种量的增加，风干肠酸味得分显著增加（P＜0.05），但LP7酸味过重。就整体可接受性而言，LP6得分最高。因此，106CFU/g为低盐风干肠中植物乳杆菌的最佳接种量。

表3 不同植物乳杆菌接种量低盐风干肠感官评价Table 3 Sensory evaluation of low-salt dry fermented sausages with different inoculum levels of L. plantarum

3 结 论

研究了植物乳杆菌接种量（105、106CFU/g和107CFU/g）对低盐风干肠品质特性及风味特征的影响。结果表明，接种植物乳杆菌能够使得风干肠在发酵初期（0～3 d）pH值快速下降，接种量为106、107CFU/g时可提高风干肠发酵结束时水分活度。电子鼻和GC-MS结果表明，接种植物乳杆菌影响了挥发性化合物的含量。整体而言，接种发酵增加了风干肠中酸和酯类化合物整体含量，降低了醛类化合物（己醛）含量，提升了风干肠的整体气味。结合多元统计分析可知，4 组风干肠的风味轮廓差异明显，植物乳杆菌接种量影响乙酸乙酯和1-戊醇等低盐风干肠中关键风味化合物含量。最后，结合感官评定确定了低盐风干肠中植物乳杆菌的最佳接种量为106CFU/g。