黄芩有效成分干预纤维化疾病研究进展

吕 鹏，刘晓明，李 芮

(1. 山东中医药大学，山东 济南 250014；2. 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

纤维化可以影响任何器官，据报道，高达45%的死亡是由纤维化造成的[1]。但是目前缺乏有效的治疗药物，所以研发多组织器官的抗纤维化药物具有重大意义。值得注意的是，虽然人们一直认为纤维化是一种持续发展和不可逆的过程，但临床前模型和各种器官系统的临床试验都表明，纤维化是一个高度动态的过程[2]，这为多组织器官新药的探索提供了有力的支撑。黄芩中的化学成分包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素A、白杨素等[3]，这些成分也存在于其他中药中，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、保肝、免疫、抗心律失常以及神经元保护作用[4]。近年来，大量的研究表明黄芩中的多种有效成分具有抗多种脏器纤维化的作用，非常值得深入研究与开发。本文就黄芩有效成分干预纤维化的作用机制进行回顾和综述。

1 抑制炎症通路并建立抗炎微环境

炎症参与组织再生和纤维化的发展，但炎症既不是组织再生的前提，也不是纤维化的必然结果[5]。通常情况下，组织损伤诱发炎症，通过招募和激活先天免疫系统和适应性免疫系统中的各种不同细胞类型参与纤维化进展。研究证实，黄芩的有效成分通过抑制细胞因子、炎症因子和免疫细胞可以成功地发挥抗纤维化作用。但是，考虑到细胞存在于一个相互作用的网络中，一组促纤维因子的抑制有可能引起另一组促纤维因子的上调，同一种促纤维因子可能同时具有抗炎和促进组织再生的作用，炎症因子本身除了诱导成纤维细胞的激活，也会分泌胶原蛋白，并且，在特定的环境中，被抑制的炎症通路可能同时具有促纤维化和抗纤维化的双重功能[5]，所以对黄芩抑制炎症通路，建立抗炎微环境的综合作用进行综合评估尤为重要。例如，有研究发现[6]，在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中，黄芩苷可以降低肺组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量，以及支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数量，在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型中，肺组织马松染色也证实了黄芩苷可显著抑制肺组织胶原纤维化，其药理作用与炎症反应有关[7]。

在所有黄芩通过调节炎症反应发挥抗纤维化作用的机制研究中，与核因子κB(NF-κB)通路相关的研究最为丰富。NF-κB通路一直被认为是一种典型的促炎信号通路，其主要依据是NF-κB在促炎基因(包括细胞因子、趋化因子和黏附分子)表达中的作用。在黄芩苷对烟雾诱导的大鼠气道炎症发挥调节作用的机制研究中发现，黄芩苷可以抑制NF-κB及其下游靶蛋白纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)的表达，起到预防气道纤维化的作用[8]。白杨素可逆转Ⅱ型肺泡上皮细胞上皮间质转化(EMT)，减轻大鼠肺纤维化，其机制可能与升高NF-κB抑制蛋白(IκB)磷酸化，抑制NF-κB/p65磷酸化和核转移，从而下调Twist 1的表达有关[9]。在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中，黄芩苷修复微生物群可逆转NF-κB信号通路的活化和糖尿病相关的肺纤维化[10]。此外，黄芩苷还被证实在心、肾、胰腺以及腹膜的纤维化中通过该通路发挥作用。如Wu等[11]的研究证实，黄芩苷作为清达颗粒的主要成分可以通过抑制NF-κB通路，改善心脏重构和炎症反应。黄芩中的另一种主要成分白杨素也被发现对心肌梗死后梗死外周区具有抗纤维化的心肌保护作用，其机制可能是上调PPAR-γ，抑制NF-κB和AP1通路[12]。在肾间质纤维化中，黄芩苷可以通过microRNA-124/TLR4/NF-κB轴抑制糖尿病肾病小鼠模型的肾纤维化进程[13]，其中TLR4是miR-124的潜在靶点，microRNA-124通过调节TLR4信号通路抑制促炎细胞因子表达，促进抗炎因子表达[14]。汉黄芩素也可以通过抑制NF-κB信号通路改善糖尿病肾病肾脏炎症和纤维化[15]。Fan等[16]还发现，黄芩苷通过抑制胰腺星状细胞活化的TGF-β1/TGF-βR1/TAK1/NF-κB信号通路，减少单核细胞趋化因子(MCP-1)的分泌，进一步减少胰腺局部微环境中巨噬细胞和炎症细胞的浸润，从而改善慢性胰腺炎小鼠胰腺纤维化。对于腹膜纤维化模型，黄芩苷也表现出来抗纤维化作用,其机制可能与其抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)表达，调控NF-κB通路有关[17]。

2 诱导肌成纤维细胞的失活与清除

肌成纤维细胞是瘢痕形成细胞，最初被认为是成纤维细胞的最终分化状态[18]，现在被理解为来自不同的祖细胞，由具有相似表型和功能的异质细胞群组成[19-20]。在纤维化进程中，肌成纤维细胞负责细胞外基质的过度合成、沉积和重塑。持续的肌成纤维细胞活动导致进行性组织纤维化，扭曲了正常组织结构，逐渐引发器官衰竭，最终导致死亡。针对肌成纤维细胞凋亡、重编程、自噬、衰老或恢复到静止表型正在成为一种新的逆转纤维化的治疗策略[5，21]。

被激活的肝星状细胞是分泌基质蛋白的肌成纤维细胞的主要细胞来源，是肝纤维化发生的主要驱动力，诱导星状细胞恢复到失活、衰老、凋亡或被免疫细胞清除使精确抗纤维化治疗成为可能[22]。相较于其他器官组织的纤维化研究，肝纤维化的课题研究者们基于这一思路开展了更多的实验研究，发现黄芩的有效成分木蝴蝶素A和汉黄芩素可以诱导已经活化的肝星状细胞凋亡[23-24]，而木蝴蝶素A还可以通过激活自噬来缓解肝星状细胞的活化从而发挥抗纤维化作用[25]。

3 调节细胞外基质的沉积

细胞外基质(ECM)是一种高度动态的结构，由负责ECM降解的特定酶介导，如金属蛋白酶(MMP)。ECM不断地经历受控的重塑，当其成分、结构、硬度等失调时，会出现多种病理状况，纤维化是其中之一[26]。转化生长因子-β(TGF-β)是这一进程的主要调节因子，可通过激活规范的(基于Smad的)和非规范的(非基于Smad的)信号通路诱导肌成纤维细胞活化，诱导EMT，导致细胞外基质过度产生，并且可以抑制细胞外基质的降解[27-29]。所以，MMP与其组织抑制剂(TIMPs)以及TGF-β是各种器官纤维化的促进剂和潜在靶点，在维持ECM稳态方面起着关键作用[26，30-31]。

多项研究表明，黄芩苷能够有效阻止TGF-β1诱导的人肺癌A549细胞上皮间质转化进程，减少TGF-β1诱导的A549细胞外基质沉积，可能是治疗肺纤维化的有效成分[32-33]。其与靶蛋白TGF-β1结合能够抑制MMP-2、TIMP-2的表达,推延肺纤维化进程[34]。同时，黄芩中的黄芩素也被证明可以通过下调结缔组织生长因子，减轻TGF- β1诱导的肺成纤维细胞I型胶原生成，从而发挥抗肺纤维化作用[35]。而在肾、肝、胰腺、肠等器官组织的纤维化中，黄芩的有效成分也被证实可以通过调节细胞外基质的沉积发挥抗纤维化作用，如黄芩苷可能通过低调节TGF-β1从而降低α-SMA的表达，延缓肾间质纤维化和肝纤维化[36-44]。白杨素也可以通过抑制TGF-β1诱导的EMT改善肺纤维化和肾纤维化[45-46]，还可以通过调节MMP/TIMP失衡和抑制胶原蛋白的产生减弱肝脏ECM积累，延缓肝纤维化进展[47]。在胰腺纤维化的小鼠模型中，黄芩苷也发挥了类似的作用，通过抑制TGF-β1/TAK-NF-κB信号通路的活化,调节MMP-1/TIMP-1的相对平衡,发挥了较好的抗胰腺纤维化的作用[48]。此外，在放射诱导的大鼠直肠纤维化模型中，黄芩苷被证明可以通过抑制EMT、隐窝细胞凋亡的激活与增殖的抑制、紧密连接屏障结构的损伤以及促炎因子表达的上调来缓解放射性辐射所致的肠纤维化损伤[49]。

黄芩的有效成分不仅可以作用于TGF-β1通路，对ECM相关的非典型TGF-β1通路[29]包括ERK、p38 MAPK、JNK和Wnt/β-catenin等也展现出了有效的靶向作用。如黄芩苷可以通过抑制Wnt3a/β-catenin信号通路和EMT相关蛋白的活化对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠发挥保护作用[50]，还可以通过ERK/GSK3β信号通路减轻辐射诱导的原代Ⅱ型肺泡上皮的EMT进程[51]。它与溶菌酶结合则可以在抗炎的基础上，通过转化生长因子-β/Smad3途径抑制细胞外基质的积累，通过胰岛素样生长因子-1/胰岛素样生长因子-1受体/p38丝裂原活化蛋白激酶途径调节细胞增殖，重新激活自噬[52]。此外，黄芩素可以通过microRNA-29激活p38MAPK-JNK抑制细胞增殖和胶原沉积[53]，这些研究都证明了黄芩有效成分对细胞外基质的沉积具有有效的调节作用。

4 抗氧化应激

氧化应激主要由活性氧(ROS)参与，并对纤维化进程产生影响。在纤维化中，ROS促进成纤维细胞和肌成纤维细胞的激活和增殖，以自分泌方式激活TGF-β通路，因此，我们可以通过提高抗氧化机制来克服ROS增加所产生的问题，其中关键的机制包括谷胱甘肽、核因子E-2相关因子2(Nrf2)和缺氧诱导转录因子(HIF-1α)，这些机制可能是创新疗法的最佳靶点[54]。

在近期的多项研究中，黄芩的有效成分被发现具有抗氧化作用。如黄芩苷在胆汁淤积性肝纤维化模型中，通过核易位增强Nrf2的激活，并诱导靶基因血红素氧合酶-1(HO-1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLM)以增强抗氧化防御[43]。Ignat等[55]则将白杨素(CHR)和环糊精(RAMEB)结合，并对不同配比的CHR - RAMEB复合物进行氧自由基吸收值、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)测定和比较，最终发现1∶2 CHR-RAMEB复合物在提高药物溶解度的基础上，还增加了氧自由基吸收值，提高了超氧化物岐化酶活性，与其他配比相比，1∶2 CHR-RAMEB复合物对谷胱甘肽过氧化物酶活性的刺激更高，可以推荐为治疗肝纤维化的候选药物。此外，研究者也发现木蝴蝶素A可以通过介导的ROS消除，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制抗炎活性，诱导自噬激活[56]，并且，木蝴蝶素A还可以通过下调YAP/HIF-1α信号通路来抑制肝纤维化中的血管新生[57]，通过抑制乳酸脱氢酶A(LDH-A)抑制氧糖酵解可减少星状细胞收缩，减轻肝纤维化[58]，被视作是黄芩中具有抗氧化活性的有效成分。

5 缓解内质网应激

大量的遗传和环境损害阻碍了细胞正确折叠，降低了翻译后修改内质网(ERs)中的蛋白分泌和跨膜的能力，导致该细胞器中错误折叠的蛋白质的堆积，称为内质网应激[59]。内质网应激既能诱导葡萄糖调节蛋白GRP78 、GRP94等内质网分子伴侣表达而产生保护效应 ,亦能独立地诱导内源性细胞凋亡，最终影响应激细胞的转归,如适应、损伤或凋亡[60]。

虽然内质网应激与纤维化疾病的关系尚在探索，但许多实验研究已经证明黄芩苷具有减少内质网应激的作用，可以对纤维化疾病有延缓或者预防作用。近几年对黄芩苷通过减少内质网应激发挥抗纤维化作用的研究多集中在心肌纤维化中，虽然黄芩苷对肾性高血压的降压效果存有争议，但是赫连曼等[61]与Dai等[62]的实验均证明，黄芩苷可以使肌细胞糖调节蛋白GRP78、GRP94、CHOP、caspase-3的表达及细胞凋亡明显降低，抑制心肌纤维化和心室重构。

6 小 结

任何器官的疾病损伤都会触发一系列复杂的细胞和分子反应，最终导致组织器官纤维化。不同组织器官的纤维化改变有着类似的致病途径，包括四个主要阶段，首先是由器官的原发损伤所驱动的反应的启动。第二阶段是效应细胞的激活，第三阶段是细胞外基质的形成，这两个阶段都与第四阶段重叠，在此期间细胞外基质的动态沉积(和降解不足)促进了纤维化的进展，最终导致器官衰竭[63]。在这些活动中已经出现了特定的细胞成分，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、上皮组织来源的细胞(上皮向间充质转化)。此外，核心分子通路也是至关重要的，例如，TGF-β通路在几乎所有类型的纤维化中都是重要的。目前有关纤维化的细胞和分子研究已非常深入，但临床仍缺乏有效的治疗方法。研究者们对黄芩抗纤维化机制进行的研究具有重要意义。一方面，研究结果证明了黄芩有效成分治疗纤维化疾病的关键机制：①抑制炎症通路并建立抗炎微环境;②诱导肌成纤维细胞的失活与清除;③调节细胞外基质的沉积;④抗氧化应激;⑤缓解内质网应激等。另一方面，也佐证了不同纤维化疾病有着类似的致病机制，为新药研发奠定研究基础。但是目前黄芩有效成分干预纤维化仍停留在动物或者体外细胞的实验研究阶段，鲜有临床转化的报道，现有的实验研究也存在着造模方法不统一，单通路研究不系统等问题。因此，作为潜力巨大的抗多组织器官纤维化药物，黄芩有效成分：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素A、白杨素的抗纤维化研究有待于进一步加强。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。