微生物腐蚀研究中代谢组学方法的应用进展

付强，许萍

(北京建筑大学 水环境国家级实验教学示范中心 城市雨水系统与水环境省部共建教育部重点实验室，北京 100044)

腐蚀经常造成严重的经济损失，在2014年，我国的腐蚀成本约为21 278.2 亿元人民币，约占当年国内生产总值的 3.34%[1]。在石油和天然气工业、冷却水系统、污水管道系统、饮用水系统和海洋工业中都经常出现微生物腐蚀的现象。其中微生物腐蚀涉及到微生物、腐蚀金属和周围环境等多个方面[2]，因此，需要研究微生物腐蚀所涉及的三个方面[3]，才能理解微生物腐蚀背后的机制并制定有效防腐蚀对策[4]，目前环境因素和腐蚀金属方面的研究已经相对充分[5-6]，但是关于腐蚀点位的微生物群落形成机制和导致微生物腐蚀发生的分子的信息尚少。

目前对微生物腐蚀中微生物群落的研究已经从对微生物计数的宏观测定发展到对微生物群落中存在的DNA的分子分析，再发展到大规模测序以确定微生物群落微生物种类[7]。表征微生物腐蚀中的微生物群落组成已被证明是有助于研究群落中不同生物体的具体功能的[8]。通过基于代谢组学的技术探索微生物腐蚀，可以进一步了解腐蚀中微生物种群的多样性及其代谢机理。

1 代谢组学研究流程与应用方法

简单来说，代谢组就是细胞在代谢过程中产生的所有低分子量(<1 500 Da)代谢物的整体集合，是生物合成/分解代谢途径的中间体或产物，并提供细胞活动和生理状态的直接功能读数[9]。而代谢组学就是针对生物代谢组进行的全面研究，其重点在于通过分析确定生物体内各种代谢物质的形成、分配过程和时空动态变化规律，结合统计生物学的大数据分析与计算机模型，在机理上探明生物代谢网络的调节规律，以达到定量预测基因变化与环境条件改变而导致的生物代谢网络的变化。代谢组学研究的典型工作流程见图1。

图1 组学研究流程图Fig.1 Flow chart of metabolomics research

1.1 样品采集与制备

微生物代谢组学的样品制备步骤包括快速取样、淬灭以及代谢物的提取[10]。样品制备是为了尽可能地去除样本中的杂质，同时尽可能的保留样品中的所需的目标代谢产物的完整性。而所需的样品提取和预处理方法会根据研究对象、目的和采用的分析技术不同而不同[11]。

细胞新陈代谢的变化速率极快，因此，样品必须快速淬灭以终止代谢反应，并且不引起代谢物的任何化学变化或从细胞内泄漏代谢物。理想的淬灭过程可以完美地将细胞冻结，完全停止所有酶的活动，以获取其“代谢快照”，但是这在处理微生物样品时是一项极其困难的任务[12]。液氮淬灭、酸碱淬灭和低温甲醇淬灭等是常用的细胞淬灭方法，低温甲醇淬灭是目前微生物代谢组学中常用方法。

在代谢物的提取过程中应去除较大的“污染”分子，如DNA、蛋白质，最后去除提取过程中使用的溶剂。代谢物提取通常包括添加有机溶剂、裂解细胞、分离代谢物、蒸发溶剂，最后留下干燥样品并冷冻储存以待使用。之后再根据不同的检测技术对样品进行相应的预处理方式。

1.2 代谢产物分析与检测

由于代谢产物的组分和数量不同，且代谢产物的官能团、挥发性、极性等存在差异，使用单一分析平台往往不能全面地进行代谢组学分析，而且各种分析平台都有其适用范围和优缺点，因此现在广泛使用多种分析平台组合的方法。表1比较了几种代谢组学常用的分析平台的特点和优缺点[13]。

表1 代谢组学常用的分析平台比较Table 1 Comparison of analysis platforms commonly used in metabolomics

在代谢组学研究技术中核磁共振(NMR)是应用最早、最为常见的技术之一。目前常用的有氢谱、碳谱和磷谱，其中以氢谱应用得最为广泛[14]。NMR 技术对样品的需求量相对较少、几乎不需要进行前处理，能快速准确地对样品进行高通量分析，且具有高重现性和无损伤性，能够提供一定条件下生物组织或体液的完整代谢产物信息[15]，能用于活体和原位研究[16]。

质谱(MS) 是通过测定质荷比和气相离子的丰度鉴定样品中存在的化学成分的含量和类型。MS仪器一般由样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理系统等部分组成。其中，离子源使样品中各组分发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用形成离子束[17]。质量分析器位于离子源和检测器之间，是质谱仪的核心组成部件，在质量分析器中利用电场和磁场将气相离子在空间或时间上按照质荷比的大小进行分离。常见的质量分析器有：飞行时间质量分析器、四极杆质量分析器、四极杆离子阱和离子回旋共振质量分析器等[18]。四级杆分析器体积小、重量轻、扫描速度快，常与其他质谱连接，是目前最成熟、应用最广泛的一种质量分析器，但它的质量范围和分辨率有限[19]。

1.3 数据处理及分析

首先对原始代谢数据需要进行预处理，使其转化成可直接用于数据统计学分析的形式。预处理之后再进行PCA和偏最小二乘法判别分析等多元统计分析和生物信息学分析，识别出生物标志物、推断代谢途径等[20]。表2给出了一些微生物代谢组学数据库，有助于识别生物标志物。

表2 微生物代谢组学数据库Table 2 Microbial metabolomics database

1.4 典型应用方法

在实验室环境中应用代谢组学研究微生物腐蚀时，典型的实验方法是，将金属试样浸泡在引起微生物腐蚀的微生物培养物中或是采集的发生微生物腐蚀的现场水中[21]，该实验方法将有助于确定培养物或现场水在腐蚀金属时发生的具体反应。首先要考虑的是是否要对代谢物进行有针对性的量化或者是代谢物的广泛无偏差的分析。而且应在实验开始时测定培养物或现场水中的代谢物，以生成现有化合物的基线轮廓，该基线轮廓再与微生物腐蚀发生后的化合物轮廓进行对比，从而确定出发生变化的化合物。并使用化学成分相同但微生物已灭活的现场水或不含微生物的无菌培养基作为对照组，以区分出微生物群落因非生物腐蚀而产生的代谢物。

在分析实验过程中采集样品时应与基线轮廓和对照组进行比较，以确定其代谢物水平与微生物群落相关。例如，在实际样品中检测到代谢物但未出现在基线中，这表明代谢物是由于腐蚀而产生的，而与对照组的比较可以确认化合物的来源是生物的或是非生物的。类似的方法可用于分析在基线中存在但在实验过程中增加或减少的化合物。

另一个重要的实验设计考虑因素是将纵向分析(即可用于在不同时间点取样的平行实验)纳入微生物腐蚀研究中，以便识别对微生物腐蚀的发生和维持起关键作用的代谢物，但这尚未纳入微生物腐蚀代谢组学分析的实验设计中，但此类分析方法已用于识别其他应用中的生物标志物[22]。

2 代谢组学在微生物腐蚀研究中的应用进展

微生物腐蚀的一个特点是差异性巨大，微生物的群落组成在不同环境之间是不同的，甚至是在两个相近腐蚀位点之间也是不同的[23]。虽然宏基因组学已成功用于识别腐蚀中的不同微生物及其相对丰度[24]，但不可能直接将微生物的相对丰度与微生物腐蚀中的致腐蚀作用联系起来。例如，虽然SRB广泛存在于腐蚀环境中，并扮演着重要的角色，但它们并不总是群落中最丰富的致腐蚀的微生物。研究显示，在美国发生微生物腐蚀现象的天然气输送管道中，SRB仅占微生物种群的1%左右，而反硝化菌占4%，产甲烷菌则占13%[25]。即使是在不同的腐蚀环境中，不同组成的微生物群落仍表现出相对相似的微生物腐蚀水平，仅仅靠识别腐蚀环境中存在的微生物不可能全面了解该系统中发生的微生物腐蚀。理解微生物群落及其与金属表面相互作用不能仅仅是基于群落中存在的微生物，还应基于群落中微生物的代谢功能。

2.1 在微生物腐蚀研究中的应用

代谢组学方法可分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学，靶向代谢组学用于研究一小部分代谢物的变化，这些代谢物是根据先验知识预先选择的。由于这些代谢物是已知的，因此通常可以用纯标准品来生成标准曲线并量化不同样品中代谢物的浓度[26]。

在微生物腐蚀的背景下，靶向代谢组学可用于量化已知与微生物腐蚀相关的微生物群落的代谢物水平，例如乙酸和丙酸。如果有来自同一微生物群落的多个时间点的样本，也可以确定这些假定的生物标志物代谢物水平的纵向或时间变化，以深入了解微生物群落中发生的代谢反应和腐蚀过程。在一项研究中，Beale等[27]直接使用从农村供水管网中获得的水进行代谢组学分析，确定了管道生物膜所表达的细胞外代谢物。随即又扩展了这项工作，成功地得到了一些水样的细胞外代谢组概况，确定了关键的代谢组生物标志物。在后续的研究中，通过从发生腐蚀微生物腐蚀的管道生物膜中提取分离微生物，分别在不暴露于铜和暴露于低水平的铜下进行了分析。根据它们的活性和铜暴露情况进行区分，研究发现，两组试验中的微生物的代谢活动会根据微生物代谢铜的能力而变化。这证明了代谢组学方法对于区分由类似的微生物组成，但是经历了不同的物理化学活动(如腐蚀和抑制腐蚀)的水网生物膜的类别的可行性。Guo等[28]运用精准靶向代谢组学和遗传学整合策略，从代谢的角度解读大肠杆菌生物膜的形成机制，在大肠杆菌生物膜体系当中精准发现和验证若干具有调控生物膜形成的功能代谢产物，并初步阐明铁载体生物合成介导的铁离子调控功能代谢物表达，进而影响生物膜形成的代谢机理。研究首次确定了5种能有效调节生物膜形成的功能代谢物(L-色氨酸、L-亮氨酸、亚精胺、50-MTA 和CMP)，初步探明了深层次的腐蚀机理，研究了基于功能代谢产物生物合成调控解离微生物生物膜形成的转化应用。在后续的研究中发现锰可以通过调节表型形态和代谢重编程来抑制生物膜的形成，发现了16种不同的功能代谢物和相关的三种代谢途径，包括糖酵解、TCA循环和色氨酸代谢，这些代谢途径在生物膜形成过程中主要被锰改变[29]。

与靶向代谢组学相比，非靶向代谢组学可用于确定样本中存在的多种代谢物的相对丰度[30]。非靶向代谢组学用于微生物腐蚀时，可以确定与微生物腐蚀相关的微生物群落中存在的不同代谢物的水平。Brauer等[31]研究了1018碳钢表面海洋细菌生物膜的化学组成与生物膜下钢的腐蚀损伤之间的相关性，首次成功地对腐蚀金属材料上的海洋生物膜进行了环境化学和代谢组学成像。通过研究发现，一些特定的代谢物与碳钢基底中腐蚀的发生和程度密切相关，而其他的则不相关。基于上述结果，他们认为生物膜代谢组与腐蚀程度和性质之间的空间相关性可以作为微生物腐蚀研究的一个有用指标。通过对不同微生物腐蚀地点的微生物群落进行非靶向代谢组学分析，有助于识别不同地点的微生物代谢，同时可以帮助识别与微生物腐蚀位置相关的关键代谢产物。例如，Bonifay等[32]将琥珀酸确定为挪威地区腐蚀管道特有的代谢产物。

2.2 在微生物腐蚀早期预测中取得的成果

特定代谢物的存在与否以及相关微生物群落组成与腐蚀之间的关系，可以理解为类似于胃肠道中某些微生物和微生物代谢物的存在与否被用来推断人体疾病的原因和后果[33]。如果在受微生物腐蚀影响的位置检测到特定代谢物，则可能表明该位置微生物群落中发生了与代谢物形成或消耗相关的代谢反应，就可以推断在这个系统中发生了微生物腐蚀。如果在多个受微生物腐蚀影响的位置检测到相同的代谢产物，这可能表明导致该代谢物产生的代谢反应在微生物腐蚀机制中具有重要作用。这项信息再与群落组成信息相结合，可以识别在不同位置对微生物腐蚀都有贡献的微生物。因此，对微生物群落的代谢物足迹进行分类研究，对于研究微生物腐蚀中的腐蚀机制具有重要的意义，在一定程度上可以预测微生物腐蚀的发生。

代谢组学通过分析微生物因其代谢活性而消耗或排泄的代谢物来推断生物膜活性，具有监测城市水网生物膜中微生物活性的潜力。Beale等[34]对发生蓝绿水现象的管道的水进行分析，用荧光光谱法快速、简便地监测配水网络和建筑管网中是否存在细胞外代谢物，用GC-MS进一步研究和鉴定相关的细胞外代谢物。以此可以确定生物膜的状态或类型，从而确定微生物腐蚀的特征，将来随着特定代谢物与不同微生物的相关性研究的增加将进一步增强该工具的实用性。

根据群落中存在的生物的代谢反应产物描述微生物群落的功能是建立在这样一个假设之上的，即微生物群落是基于群落不同成员之间的代谢反应相互作用而形成和维持的[35]。在这个模型中，假设一种微生物产生的分子被另一种微生物利用，不同微生物之间的这种合作是群落形成和维持的基础。由于不同的微生物都具有一系列执行相同生化和酶促反应的代谢机制，因此群落可能具有不同的组成，但仍在进行一组相似的反应。事实上，最近的几项微生物腐蚀研究指出微生物群落产生的分子足迹或代谢物是微生物腐蚀发生和维持的关键因素。表3是从发生微生物腐蚀的铜管道生物膜中确定的代谢物特征，这些研究发现，暴露于铜和未暴露于铜的微生物之间的代谢物主要区别在于氨基酸的存在，以及羧酸的消耗和表达，而这些有机酸在腐蚀中起着重要的作用。为了可以更全面了解管道生物膜的影响，需要研究各种管道生物膜在不同混合菌种和暴露条件下的代谢组，这可能需要大量的试验工作，并形成大量数据的集合，才有助于形成更完整的管道微生物群代谢组，代谢物表达与管道生物膜内微生物之间的关系就可以通过代谢物鉴定来推断。

表3 从发生微生物腐蚀的铜管道生物膜中确定的代谢物特征Table 3 Characteristics of metabolites determined from biofilm of copper pipeline with microbial corrosion

另外，Bonifay等[32]也在微生物腐蚀研究中经常观察到羧酸。例如，乙酸和酯、丙酸和琥珀酸是最常见的羧酸，其他羧酸如草酸和马来酸也被认为是关键的微生物腐蚀相关代谢物，除了羧酸外还发现了氨基酸和脂肪酸。尽管不常见，但在微生物腐蚀研究中，脂肪醇(如十六醇[27])以及糖磷脂[31]也都有很高的丰度，因此也被认为是关键的微生物腐蚀相关代谢物。除了所有这些类别的化合物外，还发现了与碳水化合物代谢相关的几种化合物与微生物腐蚀有关。

上述研究为利用代谢组学研究微生物腐蚀提供了坚实的基础。具体而言，这些研究表明，氨基酸、羧酸、脂肪酸和脂肪醇可能是用于代谢组学分析微生物腐蚀的理想候选物。至于是否可以作为微生物腐蚀研究的生物标志物，还需要进行更详细深入的研究。

2.3 在腐蚀机理研究方面取得的成果

代谢组学的应用有助于代谢产物酸腐蚀理论的研究，将微生物群落和代谢产物信息与检测微生物的位置所特有的腐蚀机理知识结合起来，可以全面研究微生物群落与金属表面之间的相互作用。比如基于硫酸盐还原细菌(SRB)等微生物是否直接使用金属进行新陈代谢，或诸如产酸细菌等微生物是否通过产生腐蚀性代谢物导致腐蚀。细胞外电子转移微生物腐蚀和代谢物微生物腐蚀被认为是可能的微生物腐蚀机制[39]。

除了群落结构外，鉴定群落产生的代谢物可以使我们更全面地了解微生物腐蚀中复杂的微生物和电化学之间的相互作用[30]。已经证明，生物膜的形成是在相对较短的时间内通过由微生物分泌的胞外聚合物(EPS)而形成的[40]。Keevil 等[41]将生物膜描述为一种复杂的结构，其由包裹在EPS中的小菌落排列组成，但在这些小菌落堆叠之间具有显著的通道，便于扩散。它们是大量水合的凝胶状薄膜，会对腐蚀过程产生物理影响[42]，如果在表面上不均匀分布，会导致在金属基底上建立永久的阳极和阴极区域。然而，生物膜对环境具有高度反应性，生物膜的存活需要营养转移到内部，因此，该膜不能发挥完全屏障的作用。这种开放结构意味着生物膜也可以含有氧化的腐蚀产物，甚至还可以包含特定的区域，在该区域中某些化学物质的扩散受到限制。例如，一组微生物的活动可能会阻碍或促进其他微生物的发展，SRB和铁还原细菌(IRB)之间可能存在竞争，因此IRB可能会降低SRB的活性。相比之下，产酸细菌除了本身具有腐蚀性之外，还可以提供有益于SRB生长的营养和环境条件。而生物膜和微生物对腐蚀的主要影响是通过改变阳极或阴极反应的速度来实现的。

如果阳极或阴极过程的反应物和/或产物不能自由进出金属表面，腐蚀速率可能是扩散受限或浓度受限的。Videla等[42]研究了微生物的呼吸过程如何改变金属界面的氧浓度，如果生物膜覆盖整个表面，这可能导致阴极反应速率的降低和腐蚀的减少，或者，如果涂层是不完整的，可能会产生促进局部腐蚀的电位梯度。Edyvean等[43]阐述了后一种情况，即生物膜通过形成与饮用水管道中的结节相关的氧气电池来加速腐蚀。除了氧梯度，化合物和pH梯度也可以在生物膜内产生，并可以驱动腐蚀过程。此外，酸性代谢物的产生可以通过溶解保护膜和提供氧化剂(即质子)来增加阴极过程[43]，显著降低局部pH值。Terry等[44]指出pH值的差异可能高达9个单位。硫氧化细菌可以在pH<2的情况下产生硫酸。利用氮的细菌、真菌和微藻也能产酸，这种局部酸区可以溶解任何保护膜，加速腐蚀进行。Duncan等[45]直接在管道表面沉积物中检测固着的生物和代谢物，发现了嗜热产氢产甲烷菌、同养细菌、硫代硫酸盐还原细菌和SRB。这些微生物可以通过产生有机酸、CO2、硫物质以及通过氢氧化和铁还原来促进金属腐蚀。

2.4 在微生物腐蚀研究方面的发展趋势

将代谢组学纳入微生物腐蚀研究的最后一步，也是极其重要的一步，是将代谢数据与微生物群落组成信息相结合。这不仅可以验证观察到的结果，还可以帮助识别参与代谢反应的微生物群落成员。而且，当两者结合时，这些技术的局限性可以得到改善。正如Noecker等[46]使用16SrRNA测序分析微生物的群落，利用PICRUSt软件预测群落的基因组含量。然后，预测的基因含量信息可用KEGG等数据库中相关的反应信息来推断群落的代谢潜力。这种方法既考虑了特定群体成员代谢物的产生，也考虑了其他群体成员代谢物的消耗，并预测了宏基因组中不同基因对代谢物水平增加或减少的相对贡献。预测的代谢产物表达可以与实际代谢组学数据建立联系，并且这种联系用于识别有助于群落产生特定代谢物的关键微生物。

尽管代谢组学在识别微生物腐蚀中的生物标志物和关键微生物方面具有很高的潜力，但要将其从研究工具转变为行业中的标准实践，仍然需要克服一些技术限制。从方法学的角度来看，由于微生物产生的代谢物性质的多样性，单一分析方法无法检测和识别样本中的所有代谢物[47]。因此，可能需要使用多种方法来增加代谢组覆盖率。为了使非挥发性化合物与GC-MS兼容，或者为了提高LC-MS的稳定性和与液相色谱柱的结合，通常需要化学衍生。然而，化学衍生已被证明会导致意外副产物的形成，从而导致对化合物浓度的误判。由于代谢物会快速降解，而且不同样品之间代谢产物组成的显著差异可能仅仅来自样品处理，因此在对现场样品进行代谢组学分析之前，使用正确的储存条件和样品保存技术也很重要。限制代谢组学应用于微生物腐蚀的另一个相关因素是，在样品采集和制备过程中，代谢物的空间分布信息会丢失。最后，用于识别代谢物的数据库包含关于化合物的信息通常不够完整，较少的信息量可能会限制识别代谢物的能力。

多种微生物或优势微生物往往共同影响着腐蚀的行为，微生物腐蚀研究中要高度关注微生物之间的相互作用，尽可能贴近真实的微生物腐蚀环境。然而，该领域的研究仍面临着巨大挑战。一方面是无法在实验室中再现微生物所处的复杂环境，缺少对微生物腐蚀的原位研究。另一方面，实验室中是基于可培养技术构建的生物膜系统，简化了研究，忽略了不可培养微生物在多物种生物膜中的作用。未来的研究应更加关注自然环境中的复杂微生物群落，虽然大多数MS方法不能用于获得代谢物空间定位信息，但新兴的MS技术，如成像质谱(IMS)可用于微生物生物膜中代谢物空间组织的原位分析，腐蚀中各微生物之间相互作用机理研究还需要一个从量变到质变的过程，将来随着研究的不断增多和深入，可以通过大量实验数据总结出多种微生物腐蚀的作用机理。

3 总结与展望

综上所述，代谢组学已广泛地用于微生物腐蚀的研究，为微生物腐蚀研究提供了全面系统的分析手段。在过去30年内得到迅速发展并渗透到多项领域，在科学研究与应用方面具有巨大潜力。

在研究微生物腐蚀方面代谢组学方法比其他分子方法更有优势，因为代谢组学数据提供了微生物群落中发生的生化反应的最终产物的信息，并且更适于早期检测微生物腐蚀的生物标志物。联系微生物群落组成和功能的数据来解释微生物腐蚀机制也很重要，因此，有必要将微生物群落信息与腐蚀机制知识相结合，以便全面研究微生物群落和金属表面之间的相互作用。

未来可以涵盖生物体系中多种更广阔的代谢产物的分析方法将成为研究的重点。同时，为了能有效地从庞大的数据中获取有用的信息，需要将生物信息学技术与代谢物组学更加紧密地结合，而分析统计学、代谢物组分析、数据处理分析及可视化软件的发展能更好帮助我们了解环境及基因变化对于微生物代谢网络和微生物腐蚀的影响。