卵巢高级别浆液性癌中PD-L2的表达及其临床意义

缪小兵，朱兴华，张邢松，沈 蓉，贾美群

卵巢上皮性癌是女性病死率最高的恶性肿瘤，发病隐匿，早期不易发现，约75%的患者就诊时已为晚期，晚期患者的5年生存率低于40%[1]。卵巢高级别浆液性癌(high-grade serous ovarian carcinoma, HGSOC)是卵巢上皮性癌中最常见的病理类型[2]。目前，肿瘤细胞减灭术联合以铂类为基础的化疗以及PARP抑制剂，是晚期HGSOC的标准治疗模式，但多数患者仍会出现复发、耐药，最终死亡[3]。近年，免疫治疗的快速发展为晚期HGSOC患者带来了新的希望。PD-1是细胞表面受体，主要位于T细胞表面。PD-1与PD-L1或PD-L2结合，可抑制T细胞的功能，促使肿瘤发生免疫逃逸[4]。研究发现，肿瘤免疫微环境的复杂性和多样性，可影响免疫检查点抑制剂的疗效。在多种肿瘤中，肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAM)是产生免疫抑制性肿瘤微环境的关键细胞。TAM可直接或间接调节肿瘤免疫微环境中PD-1、PD-L1/PD-L2的表达。TAM分为M1型和M2型，M1型主要发挥抗肿瘤功能，M2型则通过产生免疫抑制因子促进肿瘤进展[5-6]。目前，PD-1、PD-L1在HGSOC中的表达及作用已有较多报道，但关于PD-L2的研究甚少。本文着重探讨PD-L2在HGSOC中的表达及其临床意义，旨在为HGSOC的诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2008年1月～2019年12月我院接受初次肿瘤细胞减灭术的HGSOC石蜡标本61例。患者年龄39～78岁，中位年龄55岁，患者术前均未行放、化疗或其他特殊治疗，术后行紫杉醇+铂类(卡铂或顺铂)化疗。61例HGSOC中，术前血清CA125≤35 U/mL 5例，>35 U/mL 55例，1例患者术前血清CA125水平不详。肿瘤累及单侧卵巢26例，双侧卵巢35例；肿瘤最大径<10 cm 39例，≥10 cm 22例。病理分期按照FIGO(2014)的标准：I～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期47例。手术满意度：肿瘤细胞减灭术后无残余病灶(R0)15例，有残余病灶(NR0)46例。腹水量：≤500 mL 41例，>500 mL 20例。一线含铂化疗：铂敏感(复发时间≥6个月)49例，铂耐药(复发时间<6个月或化疗期间肿瘤进展/稳定)12例。对所有病例进行随访，截至时间2021年8月16日，中位随访时间32个月(2～125个月)。

1.2 免疫组化标本均常规取材，经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行免疫组化EnVision法染色。兔PD-L2单克隆抗体(D7U8C，稀释度1 ∶200)购自Cell Signaling Technology公司；小鼠CD68(Pan-巨噬细胞标志物)单克隆抗体(KP1，稀释度1 ∶3 000)购自Abcam公司；兔CD163(M2型巨噬细胞标志物)单克隆抗体(D6U1J，稀释度1 ∶200)购自Cell Signaling Technology公司。具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行，用已知阳性组织作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判读参考Okadome等[7]的标准，肿瘤细胞(tumor cell, TC)PD-L2根据阳性细胞染色强度和阳性细胞比例进行综合评分。(1)按阳性细胞着色强度进行评分：无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分；(2)按阳性细胞百分比进行评分：阳性细胞<10%为0分，10%～29%为1分，30%～49%为2分，≥50%为3分；两项评分相乘：≥3分为TC PD-L2阳性，<3分为TC PD-L2阴性。肿瘤浸润性免疫细胞(tumor-infiltrating immune cell, TIIC)PD-L2按阳性细胞百分比判读：≥5%为TIIC PD-L2阳性，<5%为TIIC PD-L2阴性[8]。选取4个高倍视野对CD68、CD163阳性染色细胞进行计数，并求其平均值。利用耶鲁大学开发的X-tile软件，计算CD68、CD163强、弱阳性的最佳截断值(cut-off值)。据X-tile软件计算，将阳性细胞数>78个/HPF判读为CD68强阳性，≤78个/HPF判读为CD68弱阳性；将阳性细胞数>80个/HPF判读为CD163强阳性，≤80个/HPF判读为CD163弱阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 23.0软件、GraphPad Prism软件进行统计学分析。应用Pearson χ2、Fisher精确概率法分析TC、TIIC中PD-L2表达与HGSOC临床病理特征的关系。采用非配对t检验或Mann-WhitneyU检验比较CD68、CD163阳性细胞数在TC、TIIC PD-L2阳性、阴性组间的差异。利用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存曲线的比较采用Log-rank检验。单因素和多因素预后分析，采用Cox风险比例回归模型，将单因素分析有统计学意义的变量纳入多因素Cox回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HGSOC中PD-L2的表达及其与临床病理特征的关系TC以及TIIC PD-L2阳性染色定位于细胞膜/细胞质(图1)。61例HGSOC中TC PD-L2阳性17例，阳性率27.9%；TIIC PD-L2阳性37例，阳性率60.7%。TC PD-L2表达与一线含铂化疗反应性相关，其在铂耐药患者中的阳性率(58.3%，7/12)高于铂敏感患者中的阳性率(20.4%，10/49)(P=0.026)，但TC PD-L2表达与患者年龄、术前血清CA125水平、肿瘤最大径、累及侧别、病理分期、手术满意度及腹水量均无关(P均>0.05)。TIIC PD-L2表达与患者年龄、术前血清CA125水平、肿瘤最大径、累及侧别、病理分期、手术满意度、腹水量及一线含铂化疗反应性均无关(P均>0.05，表1)。

表1 HGSOC中PD-L2表达与临床病理特征的关系

aPearson χ2检验；bFisher精确概率检验；c1例患者术前血清CA125水平不详

2.2 HGSOC中CD68、CD163的表达及其与PD-L2的关系CD68、CD163免疫组化阳性染色定位于细胞质(图2、3)。本组对CD68、CD163阳性染色细胞进行计数发现，CD68在TC PD-L2阴性组中的表达高于TC PD-L2阳性组(P<0.000 1，图4A)。与此相反，CD163在TC PD-L2阳性组中的表达高于TC PD-L2阴性组(P=0.001 1，图4B)。CD68、CD163在TIIC PD-L2阴性组与阳性组中的表达差异均无统计学意义(P均>0.05，图4C、D)。

①A①B②③

2.3 HGSOC中PD-L2表达与预后的关系61例获得随访HGSOC患者中，死亡22例(22/61，36.1%)，进展35例(35/61，57.4%)。Kaplan-Meier生存分析显示：TC PD-L2阳性患者的总生存期(overall survival, OS)和无进展生存期(progression-free survival, PFS)比阴性患者低(P均<0.05)，但TIIC PD-L2表达与OS和PFS均无关(P均>0.05，图5)。因术前血清CA125 ≤35 U/mL以及铂耐药患者例数较少，故术前血清CA125水平、一线含铂化疗反应性不纳入Cox单因素及多因素分析。Cox单因素分析显示：TC PD-L2(P=0.039)、CD68(P=0.014)、CD163(P=0.024)表达与OS相关。TC PD-L2(P=0.007)、CD68(P=0.033)、CD163(P=0.016)表达也与PFS相关。Cox多因素分析显示：TC PD-L2表达是影响OS和PFS的相关因素，但不是独立的预后因素(P均>0.05，表2)。进一步分析发现：TC PD-L2阳性、CD68弱阳性以及TC PD-L2阳性、CD163强阳性患者的预后更差(P均<0.05，图6)。

3 讨论

免疫逃逸是TC的重要特征，由多种因素介导，包括细胞表面抑制性配体(如PD-L1)。PD-L1通过与T细胞上的PD-1受体相互作用以诱导T细胞耗竭。PD-L2是PD-1受体的第二个配体，同样可抑制T细胞功能[9-10]。PD-L1在造血细胞(T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞和骨髓来源的肥大细胞)、非造血细胞(血管和淋巴管内皮细胞、上皮细胞、角质形成细胞、间充质干细胞、胎盘合体滋养细胞)以及TC上广泛表达。PD-L2与PD-L1不完全相同，其主要表达于造血细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞、骨髓来源的肥大细胞、B细胞、Th2细胞和活化的T细胞，PD-L2也可表达于TC。尽管PD-L1和PD-L2都可作为PD-1的配体，但它们有各自独特的其它结合伴侣。如PD-L1可与B7-1(CD80)结合，而PD-L2可与反义导向分子RGMb结合。PD-L1的结合伴侣B7-1主要由造血细胞和抗原呈递细胞表达，而PD-L2的结合伴侣RGMb主要表达于巨噬细胞[11]。

图4 HGSOC中PD-L2表达与CD68、CD163表达的关系：A.TC PD-L2阴性组和阳性组中CD68阳性细胞数；B.TC PD-L2阴性组和阳性组中CD163阳性细胞数；C.TIIC PD-L2阴性组和阳性组中CD68阳性细胞数；D.TIIC PD-L2阴性组和阳性组中CD163阳性细胞数

图5 HGSOC中PD-L2表达的Kaplan-Meier生存曲线：A.TC PD-L2表达与HGSOC患者OS的关系；B.TC PD-L2表达与HGSOC患者PFS的关系；C.TIIC PD-L2表达与HGSOC患者OS的关系；D.TIIC PD-L2表达与HGSOC患者PFS的关系

图6 HGSOC中TC PD-L2和CD68/CD163联合检测的Kaplan-Meier生存曲线：A.TC PD-L2与CD68不同表达组与HGSOC患者OS的关系；B.TC PD-L2与CD68不同表达组与HGSOC患者PFS的关系；C.TC PD-L2与CD163不同表达组与HGSOC患者OS的关系；D.TC PD-L2与CD163不同表达组与HGSOC患者PFS的关系

表2 Cox单因素和多因素回归模型分析HGSOC患者OS和PFS

目前，根据PD-1/PD-L1的免疫疗法在治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等晚期肿瘤中取得了令人满意的临床效果[9]。有研究报道，PD-1、PD-L1在卵巢上皮性癌肿瘤组织中的表达比癌旁组织高，浆液性癌尤为明显，且PD-1、PD-L1在病理分期晚的患者中阳性率高，患者的预后较差[4]。Webb等[12]报道HGSOC中PD-L1主要表达于肿瘤相关CD68+巨噬细胞，而TC通常不表达PD-L1。PD-L1+细胞常与CD8、CD4以及PD-1+肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)、CD25+FoxP3+调节性T细胞以及其它TIL亚群共定位，且PD-L1+患者常预后良好。近期文献报道[13]HGSOC中的PD-L1主要在巨噬细胞(而非TC)中表达，PD-1主要由淋巴细胞表达；CD3、PD-L1以及PD-1高表达患者常预后较好。目前，PD-L2在卵巢癌组织中的表达及其与患者预后关系的研究尚少。有研究报道，PD-L2在正常卵巢组织表达较低，而在卵巢癌中表达较高，在疾病进展过程中卵巢癌微环境可诱导PD-L2表达[14]。Xue等[15]报道PD-L2在卵巢癌组织中的阳性率为22.08%(17/77)。本实验显示，TC、TIIC中PD-L2在HGSOC中的阳性率分别为27.9%(17/61)、60.7%(37/61)。Xue等[15]的研究显示，PD-L2的表达状态与卵巢癌患者的临床病理特征无关，本组TC PD-L2的表达与一线含铂化疗反应性相关，其在铂耐药患者中的阳性率(58.3%，7/12)高于铂敏感患者中的阳性率(20.4%，10/49)(P=0.026)，但TC PD-L2的表达与患者年龄、术前血清CA125水平、肿瘤最大径、累及侧别、病理分期、手术满意度及腹水量均无关(P均>0.05)。TIIC PD-L2表达与患者年龄、术前血清CA125水平、肿瘤最大径、累及侧别、病理分期、手术满意度、腹水量及一线含铂化疗反应性均无关(P均>0.05)。此外，Xue等[15]报道PD-L2高表达卵巢癌患者的OS显著缩短，PD-L2高表达是卵巢癌患者的独立预后因素。本实验结果显示TC PD-L2阳性患者的OS和PFS比阴性患者低(P均<0.05)，但TIIC PD-L2的表达与OS和PFS均无关(P均>0.05)。Cox单因素和多因素分析显示：TC PD-L2表达是影响OS和PFS的相关因素，但不是独立的预后因素(P均>0.05)。

研究表明，TAM常表达PD-L1和PD-L2。通常M1型巨噬细胞主要发挥抗肿瘤功能，M2型则通过产生免疫抑制因子促进肿瘤进展。有研究认为，M1型巨噬细胞的作用是同时具有抗肿瘤和促肿瘤功能：(1)M1型巨噬细胞在免疫监视过程中发挥重要作用，M1型巨噬细胞浸润与一些肿瘤患者预后良好有关，可抑制TC增殖、诱导TC凋亡，如在肝细胞癌中，M1型巨噬细胞低浸润、M2型巨噬细胞高浸润与肝细胞癌患者预后不良有关。(2)M1型巨噬细胞还可促进肿瘤的进展，如在胰腺癌中M1型巨噬细胞可通过诱导TC上皮-间质转化促进转移[16-17]。Sumitomo等[18]报道非小细胞肺癌中M2型巨噬细胞的浸润，与较差的DFS和OS相关。本实验结果显示，CD68在TC PD-L2阴性组中的表达高于TC PD-L2阳性组(P<0.000 1)；与此相反，CD163在TC PD-L2阳性组中的表达高于TC PD-L2阴性组(P=0.001 1)。CD68、CD163在TIIC PD-L2阴性组与阳性组中的表达差异无统计学意义(P均>0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示：TC PD-L2阳性、CD68弱阳性及TC PD-L2阳性、CD163强阳性患者的预后更差(P均<0.05)。

综上所述，HGSOC中PD-L2、CD68、CD163的表达影响患者的OS和PFS。联合检测PD-L2、CD68以及CD163表达可为HGSOC患者的预后判断提供依据，同时为免疫治疗提供实验数据。