禾叶慈姑根系分泌物对4种浮游生物的生理作用研究

赵宇莹，薛晨阳，许玉凤，苏芳莉，徐树军，邵美妮,4，关 萍,4

（1.沈阳农业大学a.生物科学技术学院/全球变化与生物入侵重点实验室，b.水利学院，c.国有资产管理处，沈阳 110161；2.中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室，北京 100093；3.中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室，沈阳 110016；4.辽宁盘锦湿地生态系统国家野外科学观测研究站，辽宁 盘锦 124000）

禾叶慈姑（Sagittaria gramine）为泽泻科慈姑属的多年生水生草本植物，原产地为北美，在我国属于外来物种[1]，该植物株高约40~100cm，自身可以进行有性繁殖和无性繁殖[2]，还可与本地种慈姑（Sagittaria trifolia）进行杂交[3]。禾叶慈姑被美国农业部列为B级杂草，主要危害为过度生长造成河道的阻塞[1]。在我国亦呈现较快的扩散趋势[4]，据报道，禾叶慈姑群落发现于鸭绿江入海口湿地，仅4年时间即由零散分布扩散为巨大的群落，逐年增加的趋势十分明显[1,5]。

随着经济全球化的发展及海陆贸易的加速，引种率也随之增加，导致水生生态系统易受到外来植物的影响，威胁本地生物的生存，降低本地物种的生物多样性，影响水生环境的生态系统[6-8]。与单纯的海洋和淡水生态系统相比，海洋和淡水生态系统二者交汇处的植物，动物及微生物会受到两种生态系统的影响[9-11]。因此，该区域更容易受到外来生物的入侵，进而成为其他入侵植物的敲门砖[12]。例如，在黄河三角洲地区引种的互花米草（Spartina alterniflora）会给本地植物的生境带来威胁，降低本地水生生态系统的生物多样性[13]。

水生入侵植物对本地水生生态系统中水生生物的影响久有研究，报道较多的为互花米草、巴拉草（Brachi⁃aria mutica）、凤眼莲（Eichhornia crassipes）、穗状狐尾藻（Myriophyllum spicatum）等，它们均呈现出对本地水生生物多样性的负面影响[14-17]。有关外来水生植物化感抑制作用的研究逐渐增多[18]，水生植物释放的化感物质属于不同的化学类别，包括含氧脂肪酸、硫化合物、聚乙炔和多酚[19]。这些化感物质可以产生广泛的影响，例如减少竞争者的生长、排斥食草动物、抵抗病原体和干扰分解[20]。通过这种“利己排他”的方式，外来水生入侵植物可以占据本地植物不能利用的生态位，严重还会导致本地物种灭绝[21-22]。

由于禾叶慈姑生长地属河流入海口，为海洋与淡水的交汇处，属潮汐性淹没湿地，本研究选取本团队前期在鸭绿江口湿地调研中，筛选出来的对禾叶慈姑出现敏感的3种浮游动物和1种浮游植物为研究对象，模拟自然状态下禾叶慈姑根系分泌物对4种浮游生物的存活状况、增殖速度、细胞密度、抗氧化酶活性及对浮游植物叶绿素含量的影响，从外来植物禾叶慈姑对水生生物影响方面，评估其对水生生态系统可能产生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 禾叶慈姑根系分泌物收集禾叶慈姑于2020年6月采集自辽宁省丹东市鸭绿江入海口月亮岛大桥栈道下（采集地中心经纬度：124°21′10″E,40°5′30″N），于沈阳农业大学生物科学技术学院实验室、日光大棚及室外专用水泥池3种试验环境下进行淡水繁殖培养。该研究旨在探究禾叶慈姑对浮游生物的影响，整个过程在水环境中进行，故采用水培收集法[23-25]对禾叶慈姑根系分泌物进行收集与处理。

1.1.2 供试浮游生物分离与培养选取该研究团队前期在鸭绿江口湿地调研中，筛选水环境中对禾叶慈姑出现敏感的3种浮游动物和1种浮游植物为研究对象。浮游生物：尾草履虫（Paramecium caudatum）、多核草履虫（Paramecium polycaryum）、阔口游仆虫（Euplotes eurystomus）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）均采自禾叶慈姑采集中心点上游约200m处。将浮游生物置于体视显微镜（JM）下进行分选，选取摄食及运动状态良好的浮游生物进行繁殖培养用于后续试验。在智能人工气候培养箱（HP1500GS）中，培养条件为光照强度2000lx，光周期为12h/12h，温度为（25±1）℃（接近自然状态），分别将尾草履虫、多核草履虫、阔口游仆虫、普通小球藻接种于500mL烧杯中，分别注入480mL无菌水，每日补充20mL的所需培养液，尾草履虫、多核草履虫采用稻草水培养液[26]，阔口游仆虫采用牛肉浸膏培养液[27]，普通小球藻采用BG11培养液[25]，每日定时用玻璃棒轻轻搅动烧杯。

1.2 处理方法

1.2.1 分组及试验设计

1.2.1.1 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对3种浮游动物个体增殖效应试验试验中，将对数生长期的1只浮游动物分别置于凹玻片中进行试验，设置对照组（CK）与试验组低浓度禾叶慈姑根系分泌物（TR-L）、试验组高浓度禾叶慈姑根系分泌物（TR-H）3种处理，分别加入对应剂量培养液、禾叶慈姑根系分泌物、无菌水共计2.0mL，具体培养液及剂量见表1。

表1 禾叶慈姑根系分泌物对3种浮游动物个体增殖影响试验的添加试剂类型和剂量Table 1 Effects of root exudates of S.graminea on the individual proliferation of three species of zooplankton

1.2.1.2 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对4种浮游生物效应试验试验中，将对数生长期的浮游生物分别置于50mL三角瓶中进行试验，设置对照组（CK）与试验组低浓度禾叶慈姑根系分泌物（TR-L）、试验组高浓度禾叶慈姑根系分泌物（TR-H）3种处理。分别加入对应剂量培养液、禾叶慈姑根系分泌物、无菌水共计50mL，具体培养液及剂量见表2。

表2 禾叶慈姑根系分泌物对4种浮游生物增殖影响试验的添加试剂类型和剂量Table 2 Effects of root exudates of S.graminea on the proliferation of four species of plankton

1.2.2 测定指标不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对3种浮游动物个体增殖效应试验时间为7d，每日观测记录浮游动物的分裂数量，增殖效应的计算方法采用细胞常规计代方法[28]。不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对4种浮游生物效应试验试验时间为7d，于第7d采用血细胞计数法对浮游生物种群密度进行测定[29]，采用索莱宝抗氧化酶试剂盒及丙二醛试剂盒分别测定普通小球藻的抗氧化酶活性及丙二醛含量，采用紫外分光光度法测定浮游植物叶绿素a含量[30]。

1.3 数据分析

采用独立样本T检验对浮游动物增殖的总代数、平均个数，及浮游生物的种群密度、抗氧化酶活性、丙二醛含量及浮游植物的叶绿素a含量进行显著性分析，用SPSS 22.0（IBM SPSS Statistics 22）对数据进行分析，用Ori‐gin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对3种浮游动物个体增殖和种群密度的影响

由图1可知，3种浮游动物中的增殖均受到禾叶慈姑根系分泌物的影响。尾草履虫和多核草履虫的个体增殖效应受到显著的抑制，尾草履虫的低浓度试验组（TR-L,6.67±0.45）和高浓度试验组（TR-H,2.60±0.12）的总代数较对照组（CK,8.00±0.23）分别显著降低16.63%和67.50%（图1a,p<0.05）；多核草履虫则分别降低39.11%和57.63%（图1b,p<0.05）。阔口游仆虫的个体增殖效应则表现出低浓度下促进，高浓度下抑制（图1c、图1f）。在低浓度试验组（TR-L,14.67±0.52）处理中，阔口游仆虫的总代数较对照组（CK,10.33±0.82）显著增加42.01%；在高浓度试验组（TR-H,8.14±0.32）处理中则显著降低21.20%（图1c,p<0.05）。3种浮游动物的平均个体数的增减趋势同总代数一致（图1d、图1e、图1f）。

图1 禾叶慈姑根系分泌物对3种浮游动物个体增殖效应的影响Figure 1 Effects of root exudates of S.graminea on individual proliferation of three zooplankton species

由图2可知，尾草履虫和多核草履虫的种群密度受到显著的降低，尾草履虫的低浓度试验组（TR-L,922.20±37.00）和高浓度试验组（TR-H,265.20±31.20）的总代数较对照组（CK,1069.40±28.60）分别显著降低13.76%和75.20%（图2a,p<0.05）；多核草履虫则分别降低25.39%和57.07%（图2b,p<0.05）。阔口游仆虫的个体增殖效应则表现出低浓度下促进，高浓度下抑制（图2c）。在低浓度试验组（TR-L,1249.00±29.20）处理中，阔口游仆虫的种群密度较对照组（CK,1133.80±24.80）显著增加10.61%；在高浓度试验组（TR-H,805.40±30.40）处理中则显著降低28.96%（图2c,p<0.05）。3种浮游动物的种群密度的变化趋势同个体增殖变化趋势一致（图1）。

图2 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对3种浮游动物种群密度的影响Figure 2 Effects of different concentrations of S.graminea root exudates on the population density of three zooplankton species

2.2 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对浮游植物种群密度和叶绿素a含量的影响

由图3可知，普通小球藻的低浓度试验组（TR-L,743.80±34.20）和高浓度试验组（TR-H,536.00±44.00）的种群密度较对照组（CK,862.00±30.00）分别显著降低14.13%和38.12%（图3a,p<0.05）；普通小球藻的低浓度试验组（TR-L,10.01±0.27）和高浓度试验组（TR-H,8.76±0.24）的叶绿素a含量分别显著降低10.70%和21.86%（图3b,p<0.05）。普通小球藻的种群密度的变化趋势同其叶绿素a含量变化一致（图3）。

图3 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对浮游植物种群密度和叶绿素a含量的影响Figure 3 Effects of different concentrations of S.graminea root exudates on phytoplankton population density and chlorophyll a content

2.3 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对4种浮游生物丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响

由图4可知，尾草履虫的丙二醛含量随着禾叶慈姑根系分泌物浓度的增加而增加，尾草履虫的低浓度试验组（TR-L,0.019±0.001）和高浓度试验组（TR-H,0.025±0.001）的丙二醛含量较对照组（CK,0.016±0.002）分别增加18.75%和56.25%（图4a,p<0.05）。尾草履虫低浓度试验组（TR-L,1.310±0.020）的过氧化物酶（POD）较对照组（CK,1.570±0.040）显著降低16.56%，而高浓度试验组（TR-H,1.810±0.030）的过氧化物酶（POD）较对照组显著增加15.29%（图4b,p<0.05）。尾草履虫低浓度试验组（TR-L,0.540±0.040）的过氧化氢酶（CAT）较对照组（CK,0.610±0.060）显著降低11.48%，而高浓度试验组（TR-H,0.920±0.020）的过氧化氢酶（CAT）较对照组显著增加50.82%（图4c,p<0.05）。尾草履虫的超氧化物歧化酶（SOD）含量与禾叶慈姑根系分泌物浓度呈正相关，尾草履虫的低浓度试验组（TR-L,0.570±0.040）和高浓度实验组（TR-H,0.830±0.070）的超氧化物歧化酶（SOD）含量较对照组（CK,0.510±0.040）分别增加11.76%和62.75%（图4d,p<0.05）。

图4 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对尾草履虫丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响Figure 4 Effects of different concentrations of S.gramine root exudates on malondialdehyde content and antioxidant enzyme activity of P.caudatum

由图5可知，多核草履虫的丙二醛含量随着禾叶慈姑根系分泌物浓度的增加而增加，尾草履虫的低浓度试验组（TR-L,0.015±0.001）和高浓度试验组（TR-H,0.019±0.002）的丙二醛含量较对照组（CK,0.012±0.001）分别显著增加25.00%和58.33%（图5a,p<0.05）。多核草履虫低浓度试验组（TR-L,1.750±0.050）和高浓度试验组（TR-H,1.940±0.030）的过氧化物酶（POD）较对照组（CK,1.630±0.050）分别显著增加7.36%和19.02%（图5b,p<0.05）。多核草履虫低浓度试验组（TR-L,0.840±0.060）和高浓度试验组（TR-H,1.040±0.070）的过氧化氢酶（CAT）较对照组（CK,0.720±0.020）分别显著增加16.67%和44.44%（图5c,p<0.05）。多核草履虫低浓度试验组（TR-L,0.620±0.030）和高浓度试验组（TR-H,0.690±0.020）的超氧化物歧化酶（SOD）含量较对照组（CK,0.450±0.050）分别显著增加37.78%和53.33%（图5d,p<0.05）。

图5 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对多核草履虫丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响Figure 5 Effects of different concentrations of S.gramine root exudates on malondialdehyde content and antioxidant enzyme activity of P.polycaryum

由图6可知，阔口游仆虫的丙二醛含量随着禾叶慈姑根系分泌物浓度的增加而增加，阔口游仆虫的低浓度试验组（TR-L,0.016±0.002）和高浓度试验组（TR-H,0.023±0.001）的丙二醛含量较对照组（CK,0.014±0.003）分别增加14.29%和64.29%（图6a,p<0.05）。阔口游仆虫低浓度试验组（TR-L,1.360±0.040）的过氧化物酶（POD）较对照组（CK,1.460±0.060）降低6.85%，而高浓度试验组（TR-H,1.600±0.050）的过氧化物酶（POD）较对照组显著增加9.59%（图6b,p<0.05）。阔口游仆虫低浓度试验组（TR-L,0.880±0.040）的过氧化氢酶（CAT）较对照组（CK,0.940±0.050）降低6.38%，而高浓度试验组（TR-H,1.100±0.020）的过氧化氢酶（CAT）较对照组显著增加17.02%（图6c,p<0.05）。阔口游仆虫低浓度试验组（TR-L,0.610±0.010）和高浓度试验组（TR-H,0.580±0.070）的超氧化物歧化酶（SOD）较对照组（CK,0.470±0.020）分别显著增加29.79%和23.40%（图6d,p<0.05）。

图6 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对阔口游仆虫丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响Figure 6 Effects of different concentrations of S.gramine root exudates on malondialdehyde content and antioxidant enzyme activity of E.eurystomus

由图7可知，普通小球藻的丙二醛含量随着禾叶慈姑根系分泌物浓度的增加而增加，普通小球藻的低浓度试验组（TR-L,0.16±0.03）和高浓度试验组（TR-H,0.21±0.01）的丙二醛含量较对照组（CK,0.13±0.01）分别显著增加23.08%和61.54%（图7a,p<0.05）。普通小球藻低浓度试验组（TR-L,1.22±0.09）和高浓度试验组（TR-H,1.45±0.03）的过氧化物酶（POD）较对照组（CK,0.93±0.03）分别显著增加31.18%和55.91%（图7b,p<0.05）。普通小球藻低浓度试验组（TR-L,0.53±0.07）和高浓度试验组（TR-H,0.64±0.03）的过氧化氢酶（CAT）较对照组（CK,0.45±0.13）分别增加17.78%和42.22%（图7c,p<0.05）。普通小球藻低浓度试验组（TR-L,0.93±0.04）和高浓度试验组（TR-H,1.04±0.02）的超氧化物歧化酶（SOD）含量较对照组（CK,0.68±0.13）分别显著增加37.76%和52.94%（图7d,p<0.05）。

图7 不同浓度禾叶慈姑根系分泌物对普通小球藻丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响Figure 7 Effects of different concentrations of S.gramine root exudates on malondialdehyde content and antioxidant enzyme activity of C.vulgaris

3 讨论与结论

水生植物的根系分泌物可直接进入水环境，对水环境中的其他物种产生不同程度的影响，外来入侵植物可利用这种效应改变入侵地（水域）的环境，环境又可直接作用于生长于此的生物类群，从而通过该途径达到增加入侵能力的作用，从该条途径探索外来植物的入侵机制及防治手段具有一定的研究和应用价值[31-32]。本研究前期比较了禾叶慈姑生长地与非生长地浮游生物的种类、数量及多样性，均存在较大差异。推测禾叶慈姑的生长对其周围水环境中浮游生物的作用效应较明显，本研究对该推测进行了试验证实。

本研究结果提示3种浮游动物的增殖均在短时间内（<7d）发生了变化，浮游动物增殖的影响是多方面的，增殖速度的改变是细胞内生理活动变化的综合体现，不能单纯根据增加或减少判定环境有利或有害，阔口游仆虫的增殖增强也可能伴随细胞代谢的紊乱和寿命的减短[33]，需要设计后续试验进行详细说明。尾草履虫和多核草履虫的研究结果表明：不同浓度的根系分泌物呈现不同的抑制作用，呈正相关性，该结果提示禾叶慈姑的种群密度可直接影响生长地浮游生物的群落特征。

纤毛虫是原生动物门最高等的类群，它们的生命周期和代谢过程与高等动物相似，草履虫、四膜虫及游仆虫等已成为环境毒理学研究的模式生物[34]。本研究证实这些模式生物对入侵植物的响应各异，敏感性也由于食性及代谢方式不同存在差异。本研究应用的根系分泌物在正常生长环境中所获取，不同于高浓度提取物，更加接近于生长状态，这种极其微量未经浓缩的化学物质对多细胞动物效果很难在短时间内获取，纤毛虫在较短时间内发生了显著的变化[35]。本研结果亦提示纤毛虫作为水体与水生物互作研究的模式生物适用性较强，细胞中氧化酶类的规律变化亦提示各类群之间存在不同的敏感物质及应答方式。

水生植物根系分泌物可以降低藻类的密度，通过生态的方法降低水华现象的发生[36]，本研究证实了该结论。推测应为根系化感物质减弱普通小球藻的光合作用[37]。藻细胞受到胁迫，导致自由基的平衡被打破，活性氧的含量大量增加，抗氧化酶的活性也受到不同程度的影响[38]。水生外来植物释放的活性物质可抑制藻类的生长[37,39-40]，对改善水体富营养化具有重要的意义。防止禾叶慈姑成为恶性入侵物种的同时，亦可利用它们改善水体富营养化及防治水华等方面开发其应用价值。