叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测对早期肺癌的诊断价值

陈鹏飞 谢金标 杨天宝 王 武 陈 豪 黄国忠

莆田学院附属医院心胸外科，福建莆田 351100

据中国国家癌症中心（ChinaNationalCancerCenter，NCC）公布的最新癌症数据[1]，我国常见的癌症类型包括肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌，占比超过总癌症类型的50%。肺癌是中国最常见的癌症，如果在早期发现并进行手术切除，预后良好，5 年生存率达到70%～90%。然而，大多数患者（约75%）在确诊时已是晚期（Ⅲ/Ⅳ期）[2]。因此，对肺癌患者尽早实施诊断和治疗对患者的预后尤为关键。目前，肺部结节良、恶性的临床诊断方法是血液学检测（肿瘤标志物）、影像学检查（胸部CT）等。其中，化验肿瘤标志物的指标在肺癌和癌前病变中，癌胚抗原、肿瘤相关糖类抗原、细胞角蛋白片段等的表达率均不高，从而对临床诊断的准确性产生一定的影响。影像学检查如发现肺部小结节，患者对手术治疗的态度不明确，未能按时治疗，患者常常会错失最佳手术时机[3]。循环肿瘤细胞为患者机体的肿瘤细胞自发从原发肿瘤和转移灶或者侵入性操作导致释放入血，肿瘤细胞在循环中聚集，形成微小的瘤栓，在适宜条件下形成转移灶[4]。叶酸受体在肺癌细胞中表达率高，本研究探讨早期肺癌患者叶酸受体阳性的临床疗效。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年9 月至2021 年12 月莆田学院附属医院收治的100 例疑似肺癌患者作为研究对象，其中男57 例，女43 例；年龄44～79 岁，平均（62.16±2.51）岁。纳入标准：①临床表现不典型，只有咳嗽、胸闷、低热等呼吸道表现，胸部CT 表现为疑似肺癌的单一肺结节（最大直径＜3 cm），没有纵隔淋巴结肿大或其他转移；②所有患者知情且自愿参与本研究，临床资料完整。排除标准：①CT 显示肺部多个结节，并伴发转移；②包括外科和放射治疗患者，或者是肺部肿瘤复发患者[5]。本研究经医院医学伦理委员会批准同意（2019090），患者和家属均签署研究知情同意书。

1.2 方法

所有患者抽取3 ml 肘前静脉血，含有EDTA 的试管用于静脉血的保存，储存温度：4℃，检测时间：叶酸受体阳性的循环肿瘤细胞检测在24 h 后进行。首先采用3 ml 血液中的免疫磁性微球负向富集方法，采用配体PCR 技术对其进行定量检测，上海格诺思博生物技术有限公司为其提供的检测试剂盒，并严格按照试验试剂盒的使用方法进行操作[6]，用4 倍于3 ml 的红细胞溶解液，于4℃溶解15 min，除去红细胞，再加入150 μl 抗CD45 微球，于4℃培养30 min，除去白细胞；将抗CD14 微粒50 μl 于4℃培养30 min，将巨噬细胞剔除；将采集到的循环肿瘤细胞添加10 μl的具有肿瘤特异性的叶酸配体-寡核苷酸偶合物的探针标记液，在室温孵育40 min，然后添加1 ml 的清洗缓冲溶液，在4℃下进行10 min 的离心，以1500 r/min 的速度，离心半径15 cm，反复3 次，以除去未结合的探头；最后，添加120 μl 的洗脱缓冲溶液，4℃培养2 min，将结合的探头洗脱出来，离心收集，加入中和缓冲液24 μl，进行荧光PCR 扩增，利用ABI7300 仪器（美国爱普拜斯公司）采集PCR 信号和数据[7-8]。在此基础上，ABI7300 仪器在95℃变性2 min、40℃退火30 s、72℃延长30 s、8℃5 min 完成；40 次热处理后，95℃变性10 s、35℃退火30 s、72℃延伸10 s。在3 ml 的血液中，发现1 个循环中的叶酸受体阳性细胞，即1 FU[9]。

1.3 观察指标

记录100 例患者中的早期肺癌、肺良性结节患者的例数，叶酸受体阳性循环肿瘤细胞计数及该检测方法在临床诊断的灵敏度、特异度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线并采用Kappa 一致性检验分析诊断价值，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 早期肺癌患者和肺良性病变患者叶酸受体阳性肿瘤细胞的比较

结合患者的病理诊断结果，有75 例早期肺癌患者，25 例肺良性病变患者，早期肺癌患者的叶酸受体阳性肿瘤细胞为（11.38±1.37）FU/3 ml，高于肺良性病变患者的（8.10±1.83）FU/3 ml，差异有统计学意义（t=9.495，P＜0.05）。

2.2 叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测诊断早期肺癌的价值

以术后病理结果作为诊断肺癌的金标准，Kappa一致性检验显示叶酸受体阳性循环肿瘤诊断早期肺癌具有一定的准确性（Kappa=0.683，P＜0.05）；以叶酸受体阳性循环肿瘤细胞作为肺癌的诊断指标，ROC曲线下面积为0.810（95%CI=0.648～1.000），最佳截断值为8.7 FU/3 ml，灵敏度为87.7%，特异度为76.9%（图1）。

图1 叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测诊断价值的ROC 曲线

3 讨论

肺癌患者的人数越来越多，病情严重，具有很高的死亡率，严重威胁患者的生命安全。因此，对肺癌患者做到早诊断和早治疗尤为重要。随着居民对体检意识认知性的提高，肺结节的临床诊断率越来越高，但结节的性质、能否手术影响着患者及家属的决定[10]。

肿瘤标记物在早期肺癌的诊断中，临床参考价值较小，诊断意义不大。而外周血中肿瘤细胞的检测在临床上也有一定的局限性，目前，尚没有一种标准的方法来进行检测[11]。早期的循环肿瘤细胞可以显示出肿瘤细胞的形状，而循环肿瘤细胞的检测则是基于不同的细胞形态，对肿瘤各项数据进行分析，而不需要对细胞表面的信息进行检测，其优势在于不依赖于循环中的肿瘤细胞表面抗原，且其形态和活性保持不变，但其纯度非常低，容易失去直径较小的循环肿瘤细胞[12-14]。

叶酸受体在肺癌细胞的表达性很高，因此，叶酸受体阳性的循环肿瘤细胞检测是最理想的检测手段。通过保真放大、实时检测PCR 分子，实现双层次放大，最终完成对3 ml 血液样本中循环肿瘤细胞的检测，对检测的灵敏度有很大的改善[15]。在本研究中，通过对100 例疑似肺癌患者实施检测，比较早期肺癌的临床诊断中早期肺癌及良性肺结节患者的叶酸受体阳性循环肿瘤细胞，结果显示，叶酸受体阳性循环肿瘤细胞更高，早期肺癌患者的叶酸受体阳性肿瘤细胞含量高于肺良性病变细胞，差异有统计学意义（t=9.495，P＜0.05），同时检测Kappa 值为0.683，AUC为0.810，最佳截断值为8.7 FU/3 ml，灵敏度为87.7%，特异度为76.9%，具有一定的临床诊断价值。本研究结果与唐兴等[16]的研究结果一致，具有参考价值。

综上所述，叶酸受体阳性循环肿瘤细胞在早期肺癌的临床诊断中灵敏度较高，能够作为诊断早期肺癌的有效标记物，明确肺癌患者的具体情况，在临床上具有较高的应用价值，值得临床推广应用。