内源性神经干细胞在脊髓损伤修复中的研究进展

张 毅，张 强，曹 亮，罗张荣，李 青

脊髓损伤(SCI)是一种严重的、高度致残的、致命的一种疾病，多由意外事故引起[1]。在SCI中，初始机械作用引起的原发性损伤存在不可逆的神经细胞死亡，继而在炎症、局部缺血、脂质过氧化和细胞凋亡等多种因素作用下导致继发性损伤，最终造成轴突束断裂，引起运动或感觉功能障碍[2-3]。目前仍未找到有效的SCI治疗方法。当前SCI治疗主要集中在以下2个方面[4-5]，一方面是神经保护，通过减少或消除继发性病理反应以保护残留轴突和神经细胞，如服用类固醇药物[6]、托吡酯[7]、尼莫地平等；另一方面是神经再生和修复，通过促进神经元再生和重建突触连接，如脑源性神经营养因子(BDNF)[8]治疗、基因治疗和神经干细胞(NSCs)治疗[9]。NSCs疗法被认为是治疗SCI最有前景的方法[10]。NSCs主要存在于成人中枢神经系统(CNS)的脑和脊髓中[11-12]。NSCs在正常生理条件下保持静止，在CNS损伤等条件下可以被激活[13]。激活的NSCs可以自我更新以维持干细胞库并分化为用于组织修复的神经细胞。大量研究表明，神经元的病理性凋亡是SCI继发性损伤的主要病理基础[14]，适当诱导内源性神经干细胞(ENSCs)增殖分化为神经元以补偿神经元的损失，是减少病理损伤、促进神经再生和修复SCI的有效方法[15-16]。在此我们总结了ENSCs的特征、在SCI治疗中的意义及相关进展。

1 脊髓ENSCs的来源

在成人大脑和脊髓中发现了NSCs的存在，证明了CNS可能具有通过新生神经元修复损伤的潜力[11]。NSCs是CNS中的原始细胞，具有自我更新和多向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜力。在创伤性脑损伤等病理条件下，NSCs的增殖和神经发生增加。这些新生成的神经细胞有能力迁移到损伤部位并替换受损神经元[17]。

在脊髓中，沿中央管排列的室管膜细胞具有体外分化为神经元和胶质细胞的能力，它们被定义为NSCs[18]。室管膜细胞(CD133+/FoxJ1+)、少突胶质祖细胞(NG2+/OLIG2+)和星形胶质细胞(GFAP+/Sox9+/Cx30+)均曾被研究者认为是脊髓干细胞[19]。在完整的脊髓中，室管膜细胞很少分裂，但在细胞培养中，室管膜细胞开始剧烈分裂，并通过产生星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元，表现出多能性[20]。SCI后，室管膜细胞开始快速分裂，并在胶质瘢痕中生成超过一半的星形胶质细胞和少量的少突胶质细胞，使轴突髓鞘化[20]。少突胶质祖细胞是成人完整脊髓中主要的分裂细胞群，它们在SCI后加速分裂，并产生大量的髓鞘化少突胶质细胞。星形胶质细胞在完整的脊髓内偶尔分裂以维持其数量。损伤后，星形胶质细胞迅速分裂，形成胶质瘢痕的边界[20-21]。星形细胞和少突胶质祖细胞能够自我更新，但其不是多能细胞，这表明它们不是干细胞[20]。然而，室管膜细胞在培养中和SCI后通过生成新的室管膜细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞而显示出NSCs特性。因此，室管膜细胞代表了成人脊髓中潜在的神经干细胞群[22]。

1.1中央管内的脊髓NSCs 衬在中央管内的室管膜层被称为脊髓NSC微环境。在小鼠脊髓中，室管膜细胞起源于中期胚胎阶段(E15.5)，出生时完全包围中央管[23]。根据对FoxJ1-CreER转基因小鼠的研究，依据细胞形态室管膜细胞可分为3种基本类型：立方室管膜细胞、长柄细胞和放射状室管膜细胞[19]。立方室管膜细胞是最丰富的多纤毛细胞，而放射状室管膜细胞是数量较少的类型[24]。此外，在NSC微环境中还存在另一种细胞类型，即脑脊液-接触神经元(CSF-CNs)[25]，这些细胞主要分布在脊髓中央管的室管膜层、脊髓周围的实质及中脑和桥连接处的中脑导水管周围灰质[26]。这些细胞的一侧突出与脑脊液连接，而另一侧与脊髓实质连接，从而形成“脑-脑脊液屏障”。CALLE等[27]也证实了CSF-CNs有2种信号传递方式：一种是通过突触通讯，另一种是通过细胞间液体脑脊液介导的化学信号传递。最近的研究结果表明，CSF-CNs影响内源性神经祖细胞的表达和SCI后神经功能的恢复，并证实了PKD2L1+ CSF-CNs在体外具有NSCs的特性[28-29]。

1.2脊髓中央管室管膜细胞的异质性 研究表明，室管膜细胞具有异质性[30]。巢蛋白在室管膜细胞的背侧和腹极表达，而CD15和BLBP在背侧区域表达[18]。在成年小鼠脊髓中，含有巢蛋白的细胞数量以颈椎最多，胸椎次之，腰椎最少[31]。

2 脊髓ENSCs损伤后的反应

研究表明，NSCs在正常情况下保持静止状态或增殖非常缓慢，SCI会诱导脊髓ENSCs的激活[32]，并增殖、迁移至受损部位分化，参与组织的修复。因此，了解影响ENSCs激活的机制对SCI治疗有重大意义。

2.1脊髓ENSCs的活化和增殖 内环境变化是影响ENSCs活化、增殖的主要因素，如可溶性因子、血管破坏导致的缺氧及免疫反应的增加，可能有助于CNS损伤后NSC的活化[32-33]。血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、BDNF等生长因子在NSCs的激活中也发挥重要作用[34-35]。HAN等[36]通过条件性基因敲除方法发现，VEGF能够通过激活ERK通路和AKT通路促进NSCs的活化、增殖。有研究发现，bFGF可激活NSCs，促进其增殖分化为少突胶质祖细胞，增加脑实质中少突胶质细胞的数量，促进神经功能的恢复[37]。ZHANG等[38]将表达bFGF的NSCs移植到CNS损伤大鼠体内，发现bFGF能促进梗死区NSCs增殖、分化为成熟神经元。SCI后反应型星形胶质细胞产生的BDNF、神经营养因子-3(NT-3)、NGF和bFGF可促进血管重建，修复脑屏障，减轻水肿并阻止炎性细胞的扩散[16]。此外，还有研究表明，SCI激活免疫细胞触发多种促炎和抗炎细胞因子的释放，具有神经损伤与神经保护的双重效果[39]。小鼠ENSCs与促炎M1巨噬细胞共培养可上调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素(IL)-1β表达，并通过MAPK/Sox2信号通路促进其增殖，而与抗炎M2巨噬细胞共培养则诱导精氨酸酶和IL-10表达的上调，抑制细胞增殖，并促进向神经元分化[40]。

2.2脊髓ENSCs的迁移 SCI后3 d可以检测到激活的ENSCs从中央管向病变部位迁移[19]。迁移的细胞会改变它们的形态并失去FoxJ1、Sox2和Sox3的表达[19]。报告显示，病变部位募集的NSCs主要分化为星形胶质细胞，并在较小程度上分化为少突胶质细胞，但在损伤后不分化为神经元[19]。研究发现，炎性刺激物如干扰素-γ(IFN-γ)可激活小胶质细胞和星形胶质细胞合成趋化因子、细胞因子参与NSCs的迁移[41]。趋化因子基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)可趋化成年NSCs发生迁移，干细胞因子可趋化Nestin未分化细胞的迁移[42-43]。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)能促进NSCs迁移至损伤部位[44]。因此，SCI后炎性细胞可促进趋化蛋白的表达，引导NSCs迁移。

2.3脊髓ENSCs的分化 损伤激活的脊髓NSCs定向迁移到损伤部位是利用ENSCs进行SCI再生修复的第一步。迁移的NSCs定向神经元分化是第二个需要解决的问题。神经元分化机制近年来也得到了广泛的研究。早期研究发现SCI微环境中的Nogo-A通过激活信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路促进NSC向星形胶质细胞分化，而这可能是NSCs神经元分化所不能利用的[45]。此外，细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路参与NSCs神经元分化的调控也已被证实。ERK1/2信号通路通过调节神经生长因子和细胞周期调节因子促进NSCs增殖，抑制神经元分化，而mTOR信号通路参与胰岛素诱导的神经元分化[46-47]。髓鞘相关抑制因子(MAIs)是损伤微环境中抑制轴突再生的主要成分。最近研究发现，阻断表皮生长因子受体(EGFR)-ERK信号可拮抗MAIs，通过ERK介导的三重基序含蛋白32(TRIM32)促进NSCs的神经元分化[48]。移植NSCs的结果可能受到SCI模型和供体细胞起源的差异影响。既往研究报道，挤压和挫伤均可导致鼠或人NSC移植后少突胶质细胞分化，而部分或完全横切可诱导星形胶质细胞分化[49]。还有研究表明，大鼠脊髓NSCs移植对星形胶质细胞分化的贡献大于神经元[50]。这一证据表明，不利微环境中的多种因素阻碍了NSC向神经元分化，导致SCI部位神经元无法替代，最终阻碍了SCI后神经回路的重建和功能恢复。

3 促进ENSCs修复SCI的研究现状

尽管外源性细胞移植可能会促进SCI修复，但是与移植手术相关的致癌风险、侵袭性和并发症也应得到重视。此外，很难完全控制移植物的“命运”[51]。室管膜细胞已被证明是内源性脊髓NSCs。有尾两栖动物等一些动物表现出强大的内源性神经发生能力，并且能够在SCI后几乎完全修复受损的脊髓功能[52]。海龟会自发地重新连接切断的脊髓，在某些情况下会导致实质性恢复[53]。SCI治疗的主要目标是受损轴突的再生和白质束的再髓鞘化。因此，刺激ENSCs是一种尝试替代SCI后失去的神经元和胶质细胞的合理方法。然而，为了实现这一目标需克服NSCs微环境中广泛存在的细胞和分子变化，如细胞死亡、炎症、不同细胞群的反应性变化及细胞外环境分子组成的改变。最近研究表明，病理条件下ENSCs的行为确实可以调节，以促进中枢神经系统损伤后的功能恢复[54]。如ERLANDSSON等[54]发现使用免疫缺损NOD/SCID小鼠或与环孢霉素治疗周围性血管疾病模型，可增强SVZ衍生细胞向缺血损伤部位的迁移，使得细胞分化转向胶质细胞。

可以确定几个与治疗相关的战略目标。第一，增强胶质瘢痕的有益作用，减轻对轴突生长的抑制作用。SCI后形成的瘢痕长期以来被视为阻止轴突再生的物理屏障，大约一半的瘢痕相关星形胶质细胞来源于室管膜细胞。星形胶质细胞向瘢痕核心迁移并产生有助于轴突生长的层粘连蛋白[55]。GFAP+星形胶质细胞位于瘢痕边缘，并分泌抑制轴突生长的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)、腱生蛋白和信号素3[56]。一些研究表明，切除瘢痕组织中室管膜细胞衍生的星形胶质细胞或反应性星形胶质细胞会增强免疫细胞浸润并导致病变体积扩大、神经元死亡增加和功能结果恶化[57]，阻断室管膜细胞后代产生的瘢痕组织、病变的继发性扩大及进一步的轴突丢失[58]。此外，最近的研究报道星形胶质细胞瘢痕有助于轴突生长，RNA测序显示多种轴突生长分子在SCI星形胶质细胞和非星形胶质细胞中表达[59]。更有趣的是，在淡水龟中，活化的室管膜细胞有助于循环细胞的产生，循环细胞是SCI后允许轴突再生的重建桥架支架的重要组成部分[60]。上述研究表明这些细胞产生的瘢痕对SCI后恢复有不利和(或)有益影响。因此，增强NSCs来源的星形胶质细胞产生对能否进一步减少二次损伤和(或)在损伤部位创造一个促进生长的环境是有意义的。

第二，促进少突胶质细胞分化。脱髓鞘未修复区是SCI后的显著特征，谱系追踪研究显示少突胶质细胞约占反应性室管膜细胞子代的3%[20]。这种低比例可能是由于IL-6相关细胞因子等星形胶质细胞促进因子和骨形成蛋白在损伤的脊髓中高表达所致。神经素-2过表达的神经球在移植到损伤脊髓时促进了少突胶质细胞分化，髓鞘化增强，导致运动和感觉功能的有益改变。

第三，促进神经元分化。损伤部位的神经元丢失是SCI后功能缺陷的主要原因。近年研究人员研发了能改善SCI微环境的多种生物材料，如复合凝胶和水凝胶等可为细胞提供支持，防止胶质瘢痕形成，并改善细胞分化微环境，促进神经元分化[61-62]。FAN等[63]研究表明神经营养因子胶原结合域(CBD)-西妥昔单抗功能单元(Fab)修饰的功能性胶原蛋白支架能够在损伤微环境中持续释放西妥昔单抗，并与NSC表面的EGFR结合，促进其在损伤部位的滞留，减少胶质瘢痕形成，改善运动功能。除了西妥昔单抗的修饰作用外，LI等[64]证明负载紫杉醇脂质体的有序胶原支架可以实现紫杉醇的缓慢释放，改善再生环境，促进NSCs向神经元分化。此外，电针、火针、高压氧等物理治疗也可促进ENSCs的增殖、迁移和分化，有利于受损神经元再生[65]。研究表明，运动训练能促进内源性室管膜细胞的增殖和分化，对SCI恢复发挥关键作用[66]。SIEGENTHALER等[67]指出，自愿锻炼可减轻SCI后与年龄相关的修复缺陷，并且受伤的老年大鼠运动功能恢复率与未受伤年轻大鼠相当。

4 展望

SCI是世界性重大医学问题，已引起广泛的研究。然而，以下问题仍有待解决：①损伤诱导内源性巢蛋白阳性细胞来源。既往研究表明，脊髓横断后中央管的巢蛋白阳性细胞无法迁移到损伤部位[68]。然而近几年报道显示，损伤诱导的巢蛋白阳性细胞可迁移到损伤部位，通过定向诱导分化为神经元[64,69-70]。因此，探索损伤诱导的巢蛋白细胞起源对于未来的靶向治疗策略具有重要意义。②神经再生微环境的必要组成部分尚不清楚。SCI后，轴突脱髓鞘和胶质瘢痕形成通过一个复杂的、不断变化的过程阻碍神经再生，这个过程涉及许多信号分子和细胞类型[71]。尽管许多研究报道了相关分子的功能，但是这些分子在损伤后不同阶段的具体作用尚未系统全面了解。③对不利微环境的调节，结合NSCs的再生机制，可促进SCI后神经回路的再生。中国科学家开展了胶原支架与干细胞结合的SCI修复的国际临床研究，在SCI修复和再生医学技术应用领域的临床转化研究中处于领先地位。最新研究进展可指导临床治疗改进，应对临床SCI研究面临的现有挑战。相信不久的将来，通过深入研究，可解决上述问题，人类ENSCs移植治疗终将变成现实。